Tankewol foar it besykjen fan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar bêste resultaten riede wy oan om in nijere browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
De swarte soldaatfly (Hermetia illucens, L. 1758) is in omnivoarend detritivorous ynsekt mei in heech potinsjeel foar it benutten fan koalhydraatrike organyske byprodukten. Under koalhydraten fertrouwe swarte soldaatfliegen op oplosbere sûkers foar groei en lipidesynteze. It doel fan dizze stúdzje wie om de effekten fan mienskiplike oplosbere sûkers te evaluearjen op 'e ûntwikkeling, oerlibjen en fetsoerprofyl fan swarte soldaatfliegen. Oanfolje chicken feed mei monosaccharides en disaccharides apart. Cellulose waard brûkt as kontrôle. Larven dy't glukose, fruktose, sukroaze en maltose fiede groeiden rapper as kontrôlelarven. Yn tsjinstelling hie laktose in anty-nutritioneel effekt op larven, fertrage groei en it ferminderjen fan definitive yndividuele lichemsgewicht. Alle oplosbere sûkers makken lykwols de larven dikker dan dy dy't it kontrôledieet fiede. Opmerklik foarmen de testte sûkers it fetsoerprofyl. Maltose en sukrose fergrutte de ynhâld fan verzadigde fatty soeren yn ferliking mei cellulose. Yn tsjinstelling ta ferhege laktose de bioakkumulaasje fan dieet-ûnfersêde fatty soeren. Dizze stúdzje is de earste dy't it effekt fan oplosbere sûker oantoand op 'e fatty acid gearstalling fan swarte soldaat fly larven. Us resultaten jouwe oan dat de hifke koalhydraten in signifikant effekt hawwe op 'e fatty acid gearstalling fan swarte soldaat fly larven en kinne dêrom bepale harren definitive tapassing.
De wrâldwide fraach nei enerzjy en dierprotein bliuwt tanimme1. Yn 'e kontekst fan opwaarming fan' e wrâld is it ymperatyf om grienere alternativen te finen foar fossile enerzjy en tradisjonele metoaden foar itenproduksje, wylst de produksje ferheegje. Ynsekten binne kânsrike kandidaten om dizze problemen oan te pakken fanwege har legere gemyske gearstalling en miljeu-ynfloed yn ferliking mei tradisjonele feehâlderij2. Under ynsekten is in poerbêste kandidaat om dizze problemen oan te pakken de swarte soldaatflier (BSF), Hermetia illucens (L. 1758), in detritivorous soarte dy't by steat is om te fieden op in ferskaat oan organyske substraten3. Dêrom kin it valorisearjen fan dizze substraten fia BSF-fokken in nije boarne fan grûnstoffen meitsje om te foldwaan oan 'e behoeften fan ferskate yndustry.
BSF-larven (BSFL) kinne fiede op agraryske en agro-yndustriële byprodukten lykas brouwersnôt, grienteresiduen, fruitpulp en muffe bôle, dy't benammen geskikt binne foar BSFL-groei fanwege har hege koalhydraat (CH) 4,5, 6 ynhâld. Grutskalige produksje fan BSFL resultearret yn de foarming fan twa produkten: fecaliën, in mingsel fan substraatresten en fecaliën dy't brûkt wurde kinne as dongstof foar plantkultivaasje7, en larven, dy't benammen gearstald binne út aaiwiten, lipiden en chitin. Proteins en lipiden wurde benammen brûkt yn feehâlderij, biobrânstof en kosmetika8,9. Wat chitin oanbelanget, fynt dit biopolymeer applikaasjes yn 'e agraryske fiedingsektor, biotechnology en sûnenssoarch10.
BSF is in autogeen holometaboleus ynsekt, wat betsjuttet dat syn metamorfoaze en reproduksje, benammen de enerzjyferbrûkende stadia fan 'e libbenssyklus fan it ynsekt, folslein kinne wurde stipe troch fiedingsreserves dy't generearre wurde tidens larvalgroei11. Mear spesifyk liedt proteïne- en lipidesynteze ta de ûntwikkeling fan it fette lichem, in wichtich opslachorgaan dat enerzjy frijmakket yn 'e net-fiedende fazen fan BSF: prepupa (dat is it lêste larvalstadium wêryn't BSF-larven swart wurde by iten en sykjen foar in omjouwing geskikt foar metamorfoaze), poppen (dat wol sizze, it net-bewegende stadium wêryn't it ynsekt metamorfoaze ûndergiet), en folwoeksenen12,13. CH is de wichtichste enerzjyboarne yn it dieet fan BSF14. Under dizze fiedingsstoffen, fibrous CH lykas hemicellulose, cellulose en lignine, yn tsjinstelling ta disaccharides en polysaccharides (lykas setmoal), kin net fertarre wurde troch BSFL15,16. Digestion fan CH is in wichtige foarriedige stap foar de opname fan koalhydraten, dy't úteinlik wurde hydrolysearre ta ienfâldige sûkers yn 'e darm16. De ienfâldige sûkers kinne dan wurde opnomd (dus troch de intestinale peritrophyske membraan) en metabolisearre om enerzjy te produsearjen17. Lykas hjirboppe neamde, bewarje larven oerstallige enerzjy as lipiden yn it fet lichem12,18. De opslachlipiden besteane út triglyceriden (neutrale lipiden foarme út ien glycerolmolekule en trije fatty soeren) synthesized troch de larven út dieet ienfâldige sûkers. Dizze CH leverje de acetyl-CoA-substraten dy't nedich binne foar fatty acid (FA) biosynthese fia de fatty acid synthase en thioesterase pathways19. It fatty acid profyl fan H. illucens lipids wurdt natuerlik dominearre troch verzadigde fatty soeren (SFA) mei in hege oanpart fan laurine acid (C12:0)19,20. Dêrom wurde de hege lipide-ynhâld en fatty acid gearstalling rap beheinende faktoaren foar it brûken fan hiele larven yn feefoer, benammen yn akwakultuer wêr't polyunsaturated fatty acids (PUFA) nedich binne21.
Sûnt de ûntdekking fan it potinsjeel fan BSFL om organysk ôffal te ferminderjen, hawwe stúdzjes oer de wearde fan ferskate byprodukten sjen litten dat de gearstalling fan BSFL foar in part regele wurdt troch har dieet. Op it stuit bliuwt de regeling fan it FA-profyl fan H. illucens ferbetterje. It fermogen fan BSFL om PUFA te bioakkumulearjen is oantoand op PUFA-rike substraten lykas algen, fiskôffal, of mielen lykas flaxseed, dy't in FA-profyl fan hegere kwaliteit leveret foar dierfieding19,22,23. Yn tsjinstelling, foar byprodukten dy't net ferrike binne yn PUFA, is d'r net altyd in korrelaasje tusken de dieet-FA-profilen en de larval-FA, wat de ynfloed fan oare fiedingsstoffen oanjout24,25. Yn feite bliuwt it effekt fan digestible CH op FA-profilen min begrepen en ûndersocht24,25,26,27.
Nei it bêste fan ús kennis, hoewol totale monosaccharides en disaccharides oerfloedich binne yn it dieet fan H. illucens, bliuwt har fiedingsrol min begrepen yn H. illucens fieding. It doel fan dizze stúdzje wie om har effekten op BSFL-nutrition en lipide-komposysje te ferklearjen. Wy sille de groei, it oerlibjen en de produktiviteit fan larven evaluearje ûnder ferskate fiedingsomstannichheden. Dan sille wy de lipide-ynhâld en it fetsoerprofyl fan elk dieet beskriuwe om de effekten fan CH op BSFL-nutritionele kwaliteit te markearjen.
Wy hypoteze dat de aard fan 'e hifke CH soe beynfloedzje (1) larval groei, (2) totale lipide nivo, en (3) modulate it FA profyl. Monosaccharides kinne direkt wurde opnomd, wylst disaccharides moatte wurde hydrolysearre. Monosaccharides binne dus mear beskikber as direkte enerzjyboarnen of foarrinners foar lipogenesis fia de FA synthase en thioesterase paden, dêrmei it ferbetterjen fan H. illucens larval groei en it befoarderjen fan de accumulation fan reserve lipids (benammen laurinezuur).
De hifke CH beynfloede it gemiddelde lichemsgewicht fan larven tidens groei (fig. 1). FRU, GLU, SUC en MAL ferhege larval lichemsgewicht fergelykber mei it kontrôledieet (CEL). Yn tsjinstelling bliken LAC en GAL larvalûntwikkeling te retardearjen. Opmerklik hie LAC in signifikant negatyf effekt op larvalegroei yn ferliking mei SUC yn 'e groeiperioade: 9.16 ± 1.10 mg tsjin 15.00 ± 1.01 mg op dei 3 (F6,21 = 12.77, p <0.001; Fig. 1), 125.11 ± 426. mg en 211,79 ± 14,93 mg, respektivelik op dei 17 (F6,21 = 38,57, p <0,001; Fig. 1).
It brûken fan ferskate monosaccharides (fructose (FRU), galactose (GAL), glukoaze (GLU)), disaccharides (lactose (LAC), maltose (MAL), sukrose (SUC)) en cellulose (CEL) as kontrôles. Groei fan larven fieden mei swarte soldaatfly larven. Elk punt op 'e kromme fertsjintwurdiget it gemiddelde yndividuele gewicht (mg) berekkene troch it weagjen fan 20 willekeurich selektearre larven út in populaasje fan 100 larven (n = 4). Flaterbalken fertsjintwurdigje SD.
It CEL-dieet levere in poerbêste larvaloerlibjen fan 95,5 ± 3,8%. Boppedat waard it oerlibjen fan H. illucens fiede fiedings dy't oplosber CH befetsje (GLM: χ = 107.13, df = 21, p <0.001), dy't feroarsake waard troch MAL en SUC (disaccharides) yn 'e studearre CH. De mortaliteit wie leger as dy fan GLU, FRU, GAL (monosaccharide), en LAC (EMM: p <0.001, figuer 2).
Boxplot fan oerlibjen fan swarte soldaat fleane larven behannele mei ferskate monosaccharides (fructose, galactose, glucose), disaccharides (lactose, maltose, sukrose) en cellulose as kontrôles. Behannelingen mei deselde letter binne net signifikant ferskillend fan elkoar (EMM, p> 0,05).
Alle ûndersochte diëten lieten larven it prepupale stadium berikke. De ûndersochte CH's hawwe lykwols de neiging om larvalûntwikkeling te ferlingjen (F6,21 = 9.60, p<0.001; Tabel 1). Benammen larven dy't GAL en LAC fiede namen langer om it prepupale poadium te berikken yn ferliking mei larven dy't op CEL grutbrocht waarden (CEL-GAL: p<0.001; CEL-LAC: p<0.001; Tabel 1).
De hifke CH hie ek ferskate effekten op it larvale lichemsgewicht, mei it lichemsgewicht fan larven dy't it CEL-dieet fiede, berikke 180.19 ± 11.35 mg (F6,21 = 16.86, p <0.001; Fig. 3). FRU, GLU, MAL en SUC resultearren yn in gemiddelde lêste larvale lichemsgewicht fan mear as 200 mg, wat signifikant heger wie as dat fan CEL (p <0.05). Yn tsjinstelling hienen larven dy't GAL en LAC fiede legere lichemsgewichten, gemiddeld 177.64 ± 4.23 mg en 156.30 ± 2.59 mg, respektivelik (p <0.05). Dit effekt wie mear útsprutsen mei LAC, wêrby't definitive lichemsgewicht leger wie as mei it kontrôledieet (CEL-LAC: ferskil = 23.89 mg; p = 0.03; figuer 3).
Mean lêste gewicht fan yndividuele larven útdrukt as larval spots (mg) en swarte soldaat miggen útdrukt as histogram (g) fieden ferskillende monosaccharides (fructose, galactose, glucose), disaccharides (laktose, maltose, sucrose) en cellulose (as kontrôle). Kolumnletters fertsjintwurdigje groepen signifikant ferskillend yn totaal larvalgewicht (p <0.001). Letters ferbûn mei larve spots fertsjintwurdigje groepen mei signifikant ferskillende yndividuele larvalgewichten (p <0.001). Flaterbalken fertsjintwurdigje SD.
Maksimum yndividuele gewicht wie ûnôfhinklik fan it maksimale úteinlike totale larval koloanje gewicht. Yn feite hawwe dieten dy't FRU, GLU, MAL, en SUC befetsje, it totale larvalgewicht produsearre yn 'e tank net ferhege yn fergeliking mei CEL (figuer 3). LAC fermindere lykwols it totale gewicht signifikant (CEL-LAC: ferskil = 9.14 g; p <0.001; figuer 3).
Tabel 1 lit de opbringst sjen (larven/dei). Ynteressant wiene de optimale opbringsten fan CEL, MAL en SUC ferlykber (tabel 1). Yn tsjinstelling, FRU, GAL, GLU en LAC fermindere de opbringst yn ferliking mei CEL (tabel 1). GAL en LAC prestearren it minste: de opbringst waard halvearre nei respektivelik 0,51 ± 0,09 g larven / dei en 0,48 ± 0,06 g larven / dei (Tabel 1).
Monosaccharides en disaccharides fergrutte de lipide-ynhâld fan 'e CF-larven (tabel 1). Op it CLE-dieet waarden larven mei in lipide-ynhâld fan 23.19 ± 0.70% fan 'e DM-ynhâld krigen. Foar fergeliking wie de gemiddelde lipide-ynhâld yn larven dy't mei oplosbere sûker fiede mear as 30% (tabel 1). De hifke CH's hawwe lykwols har fetynhâld yn deselde mjitte ferhege.
As ferwachte hawwe de CG-ûnderwerpen it FA-profyl fan 'e larven yn ferskate graden beynfloede (figuer 4). De SFA-ynhâld wie heech yn alle diëten en berikte mear as 60%. MAL en SUC unbalanced it FA profyl, wat late ta in tanimming fan de SFA ynhâld. Yn it gefal fan MAL, oan 'e iene kant, late dizze ûnbalâns foaral ta in fermindering fan de ynhâld fan monounsaturated fatty soeren (MUFA) (F6,21 = 7,47; p <0,001; Fig. 4). Oan 'e oare kant wie foar SUC de fermindering mear unifoarm tusken MUFA en PUFA. LAC en MAL hienen tsjinoerstelde effekten op it FA-spektrum (SFA: F6,21 = 8.74; p <0.001; MUFA: F6,21 = 7.47; p <0.001; PUFA: χ2 = 19.60; Df = 6; p < 0.001; Fig. 4). It legere oanpart fan SFA yn LAC-fed larven liket de MUFA-ynhâld te ferheegjen. Benammen MUFA-nivo's wiene heger yn LAC-fed larven yn ferliking mei oare oplosbere sûkers útsein GAL (F6,21 = 7.47; p <0.001; figuer 4).
Gebrûk fan ferskate monosaccharides (fructose (FRU), galactose (GAL), glukoaze (GLU)), disaccharides (lactose (LAC), maltose (MAL), sukrose (SUC) en cellulose (CEL) as kontrôles, fakplot fan fatty acid gearstalling fieden oan swarte soldaat fly larven. Resultaten wurde útdrukt as persintaazje fan totale FAME. Behannelingen markearre mei ferskillende letters binne signifikant oars (p <0.001). (a) Oanpart fan verzadigde fatty soeren; (b) monounsaturated fatty soeren; (c) Polyunsaturated fatty soeren.
Under de identifisearre fatty soeren wie laurinezuur (C12:0) dominant yn alle waarnommen spektra (mear as 40%). Oare oanwêzige SFA's wiene palmitinezuur (C16:0) (minder as 10%), stearinezuur (C18:0) (minder as 2,5%) en capric acid (C10:0) (minder as 1,5%). MUFAs waarden benammen fertsjintwurdige troch oleic acid (C18: 1n9) (minder as 9.5%), wylst PUFAs wiene benammen gearstald út linoleic acid (C18: 2n6) (minder as 13.0%) (sjoch oanfoljende tabel S1). Dêrnjonken koe in lyts part fan ferbiningen net identifisearre wurde, benammen yn 'e spektra fan CEL-larven, wêr't unidentifisearre ferbining nûmer 9 (UND9) in gemiddelde fan 2,46 ± 0,52% ferantwurdelje (sjoch oanfoljende tabel S1). GC × GC-FID analyse suggerearre dat it in 20-koalstof fatty acid kin wêze mei fiif of seis dûbele obligaasjes (sjoch oanfoljende figuer S5).
De PERMANOVA-analyse liet trije ûnderskate groepen sjen op basis fan de fatty acid-profilen (F6,21 = 7.79, p <0.001; figuer 5). Principal component analysis (PCA) fan it TBC-spektrum yllustrearret dit en wurdt ferklearre troch twa komponinten (figuer 5). De wichtichste komponinten ferklearje 57,9% fan 'e fariânsje en omfetten, yn folchoarder fan belang, laurinezuur (C12:0), oleïnezuur (C18:1n9), palmitinezuur (C16:0), stearinezuur (C18:0), en linolenic acid (C18: 3n3) (sjoch figuer S4). De twadde komponint ferklearre 26,3% fan 'e fariânsje en befette, yn folchoarder fan belang, decanoic acid (C10: 0) en linoleic acid (C18: 2n6 cis) (sjoch oanfoljende figuer S4). De profilen fan dieeten mei ienfâldige sûkers (FRU, GAL en GLU) lieten ferlykbere skaaimerken sjen. Yn tsjinstelling, disaccharides joegen ferskate profilen: MAL en SUC oan 'e iene kant en LAC oan' e oare. Benammen MAL wie de ienige sûker dy't it FA-profyl feroare yn ferliking mei CEL. Derneist wie it MAL-profyl signifikant oars fan 'e FRU- en GLU-profilen. Benammen it MAL-profyl toande it heechste oanpart fan C12:0 (54.59 ± 2.17%), wêrtroch it te fergelykjen wie mei de CEL (43.10 ± 5.01%), LAC (43.35 ± 1.31%), FRU (48.90 ± 1.97%) en GLU (48,38 ± 2,17%) profilen (sjoch oanfoljende tabel S1). It MAL-spektrum toande ek de leechste C18: 1n9-ynhâld (9.52 ± 0.50%), wat it fierder differinsjearre fan de LAC (12.86 ± 0.52%) en CEL (12.40 ± 1.31%) spektra. In ferlykbere trend waard waarnommen foar C16: 0. Yn 'e twadde komponint liet it LAC-spektrum de heechste C18: 2n6-ynhâld sjen (17.22 ± 0.46%), wylst MAL de leechste toande (12.58 ± 0.67%). C18: 2n6 ûnderskiede ek LAC fan 'e kontrôle (CEL), dy't legere nivo's sjen lieten (13.41 ± 2.48%) (sjoch oanfoljende tabel S1).
PCA plot fan fatty acid profyl fan swarte soldaat fly larven mei ferskillende monosaccharides (fructose, galactose, glucose), disaccharides (lactose, maltose, sucrose) en cellulose as kontrôle.
Om de fiedingseffekten fan oplosbere sûkers op H. illucens larven te bestudearjen, waard cellulose (CEL) yn kipfoer ferfongen troch glukoaze (GLU), fruktose (FRU), galactose (GAL), maltose (MAL), sukrose (SUC), en laktose (LAC). Monosacchariden en disaccharides hienen lykwols ferskillende effekten op 'e ûntwikkeling, oerlibjen en gearstalling fan HF-larven. Bygelyks, GLU, FRU, en harren disaccharide foarmen (MAL en SUC) oefene positive stypjende effekten op larval groei, wêrtroch't se te berikken hegere definitive lichem gewicht dan CEL. Oars as ûnfertarbere CEL, kinne GLU, FRU en SUC de darmbarriêre omgean en as wichtige fiedingsboarnen tsjinje yn formulearre diëten16,28. MAL mist spesifike diertransporters en wurdt tocht dat se hydrolysearre wurde ta twa glukoasemolekulen foar assimilaasje15. Dizze molekulen wurde opslein yn it lichem fan ynsekten as in direkte enerzjyboarne of as lipiden18. Earst, oangeande de lêste, kinne guon fan 'e waarnommen intramodale ferskillen te tankjen wêze oan lytse ferskillen yn seksferhâldingen. Ommers, by H. illucens kin de fuortplanting folslein spontaan wêze: folwoeksen wyfkes hawwe fan natuere genôch aai-lizzende reserves en binne swierder as manlju29. Lipide-akkumulaasje yn BSFL korrelearret lykwols mei dieet-oplosbere CH2-yntak, lykas earder waarnommen foar GLU en xylose26,30. Bygelyks, Li et al.30 observearre dat doe't 8% GLU waard tafoege oan it larvale dieet, de lipide ynhâld fan BSF-larven ferhege troch 7.78% yn ferliking mei kontrôles. Us resultaten binne yn oerienstimming mei dizze beoardielingen, dy't sjen litte dat fetynhâld yn larven dy't de oplosbere sûker fiede, heger wie as dy fan larven dy't it CEL-dieet fiede, yn ferliking mei in ferheging fan 8.57% mei GLU-oanfolling. Ferrassend binne ferlykbere resultaten beoardiele yn larven dy't GAL en LAC fiede, nettsjinsteande de neidielige effekten op larvalgroei, lêste lichemsgewicht en oerlibjen. Larven dy't LAC fiede wiene signifikant lytser as dyjingen dy't it CEL-dieet fiede, mar har fetynhâld wie te fergelykjen mei larven dy't de oare oplosbere sûkers fiede. Dizze resultaten markearje de antinutritionele effekten fan laktose op BSFL. Earst befettet it dieet in grutte hoemannichte CH. De absorption- en hydrolysesystemen fan respektivelik monosacchariden en disaccharides kinne sêding berikke, wat knelpunten feroarsaakje yn it assimilaasjeproses. As foar hydrolyse wurdt it útfierd troch α- en β-glucosidases 31. Dizze enzymen hawwe foarkar substraten ôfhinklik fan har grutte en de gemyske ferbiningen (α of β-keppelings) tusken har konstituearjende monosacchariden 15 . Hydrolyse fan LAC nei GLU en GAL wurdt útfierd troch β-galactosidase, in enzyme waans aktiviteit is oantoand yn 'e darm fan BSF 32. De ekspresje kin lykwols net genôch wêze yn ferliking mei de hoemannichte LAC konsumearre troch larven. Yn tsjinstelling, α-glucosidase maltase en sucrase 15, dy't bekend binne dat se oerfloedich útdrukt wurde yn ynsekten, kinne grutte hoemannichten MAL en sukrose SUC ôfbrekke, wêrtroch dit satiating effekt beheine. Twads kinne antinutritionele effekten wêze fanwege de fermindere stimulearring fan ynsektenintestinale amylaseaktiviteit en it fertrage fan fiedingsgedrach yn ferliking mei oare behannelingen. Yndied binne oplosbere sûkers identifisearre as stimulators fan enzymeaktiviteit dy't wichtich binne foar ynsektenfersmoarging, lykas amylase, en as triggers fan 'e fiedingsrespons33,34,35. De mjitte fan stimulearring ferskilt ôfhinklik fan 'e molekulêre struktuer fan' e sûker. Yn feite, disaccharides fereaskje hydrolyse foar absorption en tend to stimulearjen amylase mear as harren gearstalling monosaccharides34. Yn tsjinstelling, LAC hat in mylder effekt en is fûn te wêzen net by steat om te stypjen ynsekten groei yn ferskate soarten33,35. Bygelyks, yn 'e pest Spodoptera exigua (Boddie 1850), waard gjin hydrolytyske aktiviteit fan LAC ûntdutsen yn ekstrakten fan caterpillar midgut enzymen36.
Wat it FA-spektrum oanbelanget, jouwe ús resultaten signifikante modulatoryske effekten oan fan 'e hifke CH. Opmerklik, hoewol laurinezuur (C12: 0) minder dan 1% fan 'e totale FA yn' e dieet ferantwurde, dominearre it yn alle profilen (sjoch oanfoljende tabel S1). Dit is konsekwint mei eardere gegevens dat laurinezuur wurdt synthesized út dieet CH yn H. illucens fia in paad wêrby't acetyl-CoA carboxylase en FA synthase19,27,37. Us resultaten befêstigje dat CEL foar in grut part ûnfertarber is en fungearret as in "bulkmiddel" yn BSF-kontrôledieten, lykas besprutsen yn ferskate BSFL-stúdzjes38,39,40. It ferfangen fan CEL mei monosaccharides en disaccharides oars as LAC fergrutte de C12: 0-ferhâlding, wat oanjout op ferhege CH-opname troch larven. Ynteressant befoarderje de disaccharides MAL en SUC de synteze fan laurinezuur effisjinter dan har gearstallende monosaccharides, wat suggerearret dat nettsjinsteande de hegere graad fan polymerisaasje fan GLU en FRU, en sûnt Drosophila de ienige sukrosetransporter is dy't is identifisearre yn dierproteinsoarten, disaccharidetransporters kin net oanwêzich wêze yn 'e darm fan H. illucens larvae15, it brûken fan GLU en FRU wurdt ferhege. Hoewol GLU en FRU teoretysk makliker wurde metabolisearre troch BSF, wurde se lykwols makliker metabolisearre troch substraten en darmmikro-organismen, wat kin resultearje yn har rapper degradaasje en fermindere gebrûk troch larven yn ferliking mei disaccharides.
Op it earste each wie de lipide-ynhâld fan larven fied LAC en MAL fergelykber, wat oanjout op ferlykbere biobeskikberens fan dizze sûkers. Lykwols, ferrassend, it FA profyl fan LAC wie riker yn SFA, benammen mei legere C12: 0 ynhâld, ferlike mei MAL. Ien hypoteze om dit ferskil te ferklearjen is dat LAC de bioakkumulaasje fan dieet-FA kin stimulearje fia acetyl-CoA FA-syntase. Stipe dizze hypoteze, LAC-larven hienen de leechste decanoate (C10:0) ratio (0.77 ± 0.13%) as it CEL-dieet (1.27 ± 0.16%), wat oanjout op fermindere FA-syntase- en thioesterase-aktiviteiten19. Twad, dieet fatty soeren wurde beskôge as de wichtichste faktor dy't beynfloedet de SFA gearstalling fan H. illucens27. Yn ús eksperiminten, linoleic acid (C18: 2n6) goed foar 54,81% fan dieet fatty soeren, mei it oanpart yn LAC larven wie 17,22 ± 0,46% en yn MAL 12,58 ± 0,67%. Oleic acid (cis + trans C18: 1n9) (23,22% yn it dieet) liet in ferlykbere trend sjen. De ferhâlding fan α-linolenic acid (C18: 3n3) ek stipet de bioaccumulation hypoteze. It is bekend dat dit fatty acid accumulearret yn BSFL by substraatferriking, lykas de tafoeging fan flaxseedcake, oant 6-9% fan 'e totale fatty soeren yn larven19. Yn ferrike diëten kin C18: 3n3 oant 35% fan 'e totale fiedingsfetsoeren ferantwurdzje. Lykwols, yn ús stúdzje, C18: 3n3 goed foar mar 2.51% fan it fatty acid profyl. Hoewol it oanpart fûn yn 'e natuer leger wie yn ús larven, wie dit oanpart heger yn LAC-larven (0.87 ± 0.02%) as yn MAL (0.49 ± 0.04%) (p <0.001; sjoch oanfoljende tabel S1). It CEL-dieet hie in tuskenlizzende oanpart fan 0,72 ± 0,18%. Uteinlik wjerspegelet de ferhâlding fan palmitinezuur (C16: 0) yn CF-larven de bydrage fan syntetyske paden en dieet FA19. Hoch et al. 19 observearre dat C16: 0 synteze waard fermindere doe't it dieet waard ferrike mei flaxseed meal, dat waard taskreaun oan in fermindering fan de beskikberens fan de acetyl-CoA substraat troch in fermindering fan de CH-ferhâlding. Ferrassend, hoewol beide fiedings ferlykbere CH-ynhâld hienen en MAL in hegere biobeskikberens toande, lieten MAL-larven de leechste C16:0-ferhâlding sjen (10.46 ± 0.77%), wylst LAC in hegere oanpart toande, goed foar 12.85 ± 0.27% (p <0.05; sjoch; sjoch Oanfoljende tabel S1). Dizze resultaten markearje de komplekse ynfloed fan fiedingsstoffen op BSFL spiisfertarring en metabolisme. Op it stuit is ûndersyk nei dit ûnderwerp yngeandiger yn Lepidoptera as yn Diptera. Yn rûpen waard LAC identifisearre as in swak stimulant fan fiedingsgedrach yn ferliking mei oare oplosbere sûkers lykas SUC en FRU34,35. Benammen yn Spodopteralittoralis (Boisduval 1833) stimulearre MAL-konsumpsje amylolytyske aktiviteit yn 'e darm yn gruttere mjitte as LAC34. Fergelykbere effekten yn BSFL kinne de ferbettere stimulearring fan 'e C12: 0 synthetyske paad yn MAL-larven ferklearje, dy't assosjeare is mei ferhege intestinaal absorbearre CH, langere fieding, en intestinale amylase-aksje. Minder stimulearring fan it fiedingsritme yn 'e oanwêzigens fan LAC kin ek de stadiger groei fan LAC-larven ferklearje. Boppedat, Liu Yanxia et al. 27 konstatearre dat de planke libben fan lipiden yn H. illucens substrates wie langer as dat fan CH. Dêrom kinne LAC-larven mear fertrouwe op dieetlipiden om har ûntwikkeling te foltôgjen, wat har definitive lipide-ynhâld kin ferheegje en har fetsoerprofyl moduleare.
Nei it bêste fan ús kennis hawwe mar in pear stúdzjes de effekten fan monosaccharide en disaccharide oanfolling oan BSF-diëten hifke op har FA-profilen. Earst, Li et al. 30 beoardiele de effekten fan GLU en xylose en observearre lipidenivo's fergelykber mei ús op in 8% tafoegingsnivo. It FA-profyl wie net detaillearre en bestie benammen út SFA, mar der waarden gjin ferskillen fûn tusken de twa sûkers of wannear't se tagelyk presintearre waarden30. Fierder, Cohn et al. 41 toande gjin effekt fan 20% GLU, SUC, FRU en GAL tafoeging oan chicken feed op de respektivelike FA profilen. Dizze spektra waarden krigen fan technyske earder as biologyske replikaten, dy't, lykas ferklearre troch de auteurs, de statistyske analyze kinne beheine. Fierder beheint it ûntbrekken fan iso-sûkerkontrôle (mei CEL) de ynterpretaasje fan 'e resultaten. Koartlyn hawwe twa stúdzjes fan Nugroho RA et al. oantoand anomalies yn 'e FA-spektra42,43. Yn 'e earste stúdzje, Nugroho RA et al. 43 testte it effekt fan it tafoegjen fan FRU oan fermentearre palmkearnmiel. It FA-profyl fan 'e resultearjende larven toande abnormaal hege nivo's fan PUFA, wêrfan mear as 90% ôflaat wiene fan it dieet mei 10% FRU (lykas ús stúdzje). Hoewol dit dieet PUFA-rike fiskpellets befette, wiene de rapportearre FA-profylwearden fan 'e larven op' e kontrôledieet besteande út 100% fermentearre PCM net yn oerienstimming mei in earder rapporteare profyl, benammen it abnormale nivo fan C18: 3n3 fan 17.77 ± 1,67% en 26,08 ± 0,20% foar konjugearre linoleïnezuur (C18: 2n6t), in seldsum isomer fan linoleic acid. De twadde stúdzje toande ferlykbere resultaten ynklusyf FRU, GLU, MAL en SUC42 yn fermentearre palmkearnmiel. Dizze stúdzjes, lykas uzes, markearje serieuze swierrichheden by it fergelykjen fan resultaten fan BSF-larval dieetproeven, lykas kontrôlekeuzes, ynteraksjes mei oare fiedingsboarnen, en FA-analysemetoaden.
Tidens de eksperiminten konstatearren wy dat de kleur en geur fan it substraat farieare ôfhinklik fan it brûkte dieet. Dit suggerearret dat mikro-organismen in rol spylje kinne yn 'e resultaten dy't beoardiele wurde yn it substraat en it digestive systeem fan 'e larven. Eins wurde monosaccharides en disaccharides maklik metabolisearre troch kolonisearjende mikroorganismen. De rappe konsumpsje fan oplosbere sûkers troch mikro-organismen kin resultearje yn 'e frijlitting fan grutte hoemannichten mikrobiële metabolike produkten lykas ethanol, melksûr, fettsûren mei koarte keten (bygelyks acetic acid, propionic acid, butyric acid) en koalstofdiokside44. Guon fan dizze ferbiningen kinne ferantwurdlik wêze foar de deadlike giftige effekten op larven ek waarnommen troch Cohn et al.41 ûnder ferlykbere ûntwikkelingsomstannichheden. Etanol is bygelyks skealik foar ynsekten45. Grutte hoemannichten koalstofdiokside útstjit kin resultearje yn syn accumulation oan 'e boaiem fan' e tank, dat kin ûntnimme de sfear fan soerstof as lucht sirkulaasje net tastean syn frijlitting. Wat SCFA's oanbelanget, bliuwe har effekten op ynsekten, benammen H. illucens, min begrepen, hoewol't melksûr, propionzuur en bûtersoer deadlik is oantoand yn Callosobruchus maculatus (Fabricius 1775)46. Yn Drosophila melanogaster Meigen 1830 binne dizze SCFA's olfaktoryske markers dy't froulju liede nei oviposysjeplakken, wat suggerearret in foardielige rol yn larvalûntwikkeling47. Azijnzuur wurdt lykwols klassifisearre as in gefaarlike stof en kin de ûntwikkeling fan larven signifikant remme47. Yn tsjinstelling, mikrobieel ôflaat laktaat is koartlyn fûn in beskermjende effekt te hawwen tsjin invasive darmmikroben yn Drosophila48. Fierder spylje mikro-organismen yn it spijsverteringssysteem ek in rol by de fersmoarging fan CH by ynsekten49. Fysiologyske effekten fan SCFA's op 'e darmmikrobiota, lykas fiedingsrate en geneekspresje, binne beskreaun yn vertebraten 50. Se kinne ek in trofysk effekt hawwe op H. illucens-larven en kinne foar in part bydrage oan de regeling fan FA-profilen. Stúdzjes oer de fiedingseffekten fan dizze mikrobiële fermentaasjeprodukten sille har effekten op H. illucens fieding ferdúdlikje en in basis jaan foar takomstige stúdzjes oer foardielige of skealike mikroorganismen yn termen fan har ûntwikkeling en de wearde fan FA-rike substraten. Yn dit ferbân wurdt de rol fan mikro-organismen yn 'e spijsverteringsprosessen fan ynsekten dy't massaal pleatst wurde hieltyd mear ûndersocht. Ynsekten begjinne te sjen as bioreaktors, dy't pH- en oxygenaasjebetingsten leverje dy't de ûntwikkeling fan mikroorganismen fasilitearje dy't spesjalisearre binne yn 'e degradaasje of detoxifikaasje fan fiedingsstoffen dy't dreech binne foar ynsekten om te fertarren 51 . Koartlyn hat Xiang et al.52 oantoand dat bygelyks ynokulaasje fan organysk ôffal mei in baktearje mingsel CF mooglik makket om baktearjes te lûken dy't spesjalisearre binne yn lignocellulose-degradaasje, it ferbetterjen fan har degradaasje yn it substraat yn ferliking mei substraten sûnder larven.
Uteinlik, oangeande it foardielich gebrûk fan organysk ôffal troch H. illucens, produsearren de CEL- en SUC-dieten it heechste oantal larven per dei. Dit betsjut dat nettsjinsteande it legere definitive gewicht fan yndividuele yndividuen, it totale larvalgewicht produsearre op in substraat besteande út ûnfertarbere CH is te fergelykjen mei dat krigen op in homosaccharide-dieet mei monosacchariden en disaccharides. Yn ús stúdzje is it wichtich om te notearjen dat de nivo's fan oare fiedingsstoffen genôch binne om de groei fan 'e larvalbefolking te stypjen en dat de tafoeging fan CEL beheind wurde moat. De definitive gearstalling fan 'e larven ferskilt lykwols, en markearret it belang fan it kiezen fan' e juste strategy foar it valorisearjen fan 'e ynsekten. CEL-larven dy't mei folslein fied fiede binne geskikter foar gebrûk as feefoer fanwegen har legere fetynhâld en legere laurinesoernivo's, wylst larven dy't mei SUC- of MAL-fiedings fiede, ûntfetting nedich binne troch te drukken om de wearde fan 'e oalje te ferheegjen, benammen yn' e biobrânstof sektor. LAC wurdt fûn yn byprodukten fan suvelyndustry lykas wei út tsiisproduksje. Koartlyn ferbettere it gebrûk (3,5% lactose) it lêste larvale lichemsgewicht53. It kontrôledieet yn dizze stúdzje befette lykwols de helte fan 'e lipide-ynhâld. Dêrom kinne de antinutritionele effekten fan LAC wurde tsjinwurke troch larvale bioakkumulaasje fan dieetlipiden.
Lykas sjen litten troch eardere stúdzjes, de eigenskippen fan monosaccharides en disaccharides signifikant beynfloedzje de groei fan BSFL en modulate syn FA profyl. Benammen LAC liket in antynutritionele rol te spyljen by larvalûntwikkeling troch it beheinen fan de beskikberens fan CH foar dieet-lipide-absorption, en befoarderet dêrmei UFA-bioakkumulaasje. Yn dit ferbân soe it ynteressant wêze om bioassays út te fieren mei diëten dy't PUFA en LAC kombinearje. Fierder bliuwt de rol fan mikro-organismen, benammen de rol fan mikrobiële metaboliten (lykas SCFA's) ôflaat fan sûkerfermentaasjeprosessen, in ûndersyksûnderwerp dat wurdich is om te ûndersykjen.
Ynsekten waarden krigen fan 'e BSF-koloanje fan it Laboratoarium foar funksjonele en evolúsjonêre entomology fêstige yn 2017 by Agro-Bio Tech, Gembloux, Belgje (foar mear details oer opfiedingmetoaden, sjoch Hoc et al. 19). Foar eksperimintele proeven waarden 2,0 g BSF-aaien deistich willekeurich sammele út fokkoaien en ynkubeare yn 2,0 kg 70% wiete kipfoer (Aveve, Leuven, Belgje). Fiif dagen nei it útbrekken waarden larven fan it substraat skieden en mei de hân teld foar eksperimintele doelen. It earste gewicht fan elke batch waard mjitten. It gemiddelde yndividuele gewicht wie 7.125 ± 0.41 mg, en it gemiddelde foar elke behanneling wurdt werjûn yn oanfoljende tabel S2.
De dieetformulering waard oanpast út 'e stúdzje fan Barragan-Fonseca et al. 38 . Koartsein waard in kompromis fûn tusken deselde feedkwaliteit foar larvale hinnen, ferlykbere ynhâld fan droege stof (DM), hege CH (10% basearre op farsk dieet) en tekstuer, om't ienfâldige sûkers en disaccharide gjin tekstuerlike eigenskippen hawwe. Neffens de ynformaasje fan 'e fabrikant (Chicken Feed, AVEVE, Leuven, Belgje), waard de hifke CH (dws oplosbere sûker) apart tafoege as in autoklave wetterige oplossing (15,9%) oan in dieet besteande út 16,0% proteïne, 5,0% totale lipiden, 11,9% gemalen hinnefoer besteande út jiske en 4,8% fezels. Yn elke 750 ml jar (17,20 × 11,50 × 6,00 sm, AVA, Tempsee, Belgje) waard 101,9 g fan autoklave CH-oplossing mingd mei 37,8 g kipfeed. Foar elke dieet wie de ynhâld fan droege stof 37,0%, ynklusyf homogene proteïne (11,7%), homogene lipiden (3,7%) en homogene sûkers (26,9% fan tafoege CH). De CH-testen wiene glukoaze (GLU), fruktose (FRU), galactose (GAL), maltose (MAL), sukrose (SUC) en laktose (LAC). It kontrôledieet bestie út cellulose (CEL), dy't beskôge wurdt as ûnferjitlik foar H. illucens larven 38. Hûndert 5-dagen-âlde larven waarden pleatst yn in bak mei in deksel mei in gat mei in diameter fan 1 sm yn 't midden en bedekt mei in plestik muskietnet. Elk dieet waard fjouwer kear werhelle.
Larvalgewichten waarden trije dagen nei it begjin fan it eksperimint mjitten. Foar elke mjitting waarden 20 larven fan 'e substrat fuortsmiten mei sterile waarme wetter en pincet, droege en woegen (STX223, Ohaus Scout, Parsippany, USA). Nei it weagjen waarden larven werombrocht nei it sintrum fan it substraat. Mjittingen waarden regelmjittich trije kear yn 'e wike dien oant de earste prepupa ûntstie. Op dit punt sammelje, telle en weagje alle larven lykas earder beskreaun. Separate faze 6 larven (dat wol sizze, wite larven dy't oerienkomme mei it larvalstadium foarôfgeand oan it prepupale poadium) en prepupae (dat wol sizze, it lêste larvestadium wêryn't BSF-larven swart wurde, stopje mei iten en sykje in omjouwing geskikt foar metamorfoaze) en bewarje by - 18 ° C foar gearstalling analyze. De opbringst waard berekkene as de ferhâlding fan 'e totale massa fan ynsekten (larven en prepupae fan poadium 6) krigen per skûtel (g) oant de ûntwikkelingstiid (d). Alle gemiddelde wearden yn 'e tekst wurde útdrukt as: gemiddelde ± SD.
Alle folgjende stappen mei solvents (hexane (Hex), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH)) waarden útfierd ûnder in dampkap en ferplichte it dragen fan nitrilhandschoenen, skuorren en feiligensbrillen.
Wite larven waarden droege yn in FreeZone6 freeze droeger (Labconco Corp., Kansas City, MO, USA) foar 72 h en dan gemalen (IKA A10, Staufen, Dútslân). Totale lipiden waarden ekstrahearre út ± 1 g poeder mei de Folch-metoade 54. De oerbliuwende fochtynhâld fan elke lyofilisearre sample waard yn duplikaat bepaald mei in fochtanalysator (MA 150, Sartorius, Göttiggen, Dútslân) om te korrigearjen foar totale lipiden.
Totale lipiden waarden transesterifisearre ûnder soere omstannichheden om fatty acid methylesters te krijen. Koartsein, sawat 10 mg lipiden / 100 µl CHCl3-oplossing (100 µl) waard ferdampt mei stikstof yn in 8 ml Pyrex ©-buis (SciLabware - DWK Life Sciences, Londen, UK). De buis waard pleatst yn Hex (0,5 ml) (PESTINORM®SUPRATRACE n-Hexane> 95% foar organyske spoarenanalyse, VWR Chemicals, Radnor, PA, USA) en Hex/MeOH/BF3 (20/25/55) oplossing (0,5) ml) yn in wetterbad op 70 ° C foar 90 min. Nei it koeljen waarden 10% waterige H2SO4-oplossing (0,2 ml) en verzadigde NaCl-oplossing (0,5 ml) tafoege. Mix de buis en folje it mingsel mei skjinne Hex (8,0 mL). In diel fan 'e boppeste faze waard oerbrocht nei in fial en analysearre troch gaschromatografy mei in flamionisaasjedetektor (GC-FID). Samples waarden analysearre mei in Trace GC Ultra (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) foarsjoen fan in split/splitless injector (240 ° C) yn split modus (split flow: 10 mL / min), in Stabilwax®-DA kolom ( 30 m, 0,25 mm id, 0,25 μm, Restek Corp., Bellefonte, PA, USA) en in FID (250 °C). It temperatuerprogramma waard as folget ynsteld: 50 °C foar 1 min, ferheegjen nei 150 °C by 30 °C / min, ferheegjen nei 240 °C by 4 °C / min en trochgean op 240 °C foar 5 min. Hex waard brûkt as blank en in referinsjestandert mei 37 fatty acid methyl esters (Supelco 37-komponint FAMEmix, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgje) waard brûkt foar identifikaasje. De identifikaasje fan unsaturated fatty acids (UFAs) waard befêstige troch wiidweidige twadiminsjonale GC (GC × GC-FID) en de oanwêzigens fan isomers waard sekuer bepaald troch in lichte oanpassing fan de metoade fan Ferrara et al. 55. Instrument details kinne fûn wurde yn oanfoljende tabel S3 en de resultaten yn oanfoljende figuer S5.
De gegevens wurde presintearre yn Excel-spreadsheetformaat (Microsoft Corporation, Redmond, WA, Feriene Steaten). Statistyske analyze waard útfierd mei R Studio (ferzje 2023.12.1+402, Boston, FS) 56. Gegevens oer larvalgewicht, ûntwikkelingstiid en produktiviteit waarden rûsd mei it lineêre model (LM) (kommando "lm", R-pakket "stats" 56) sa't se passe in Gaussiaanske ferdieling. Survivalraten mei help fan binomiale modelanalyse waarden rûsd mei it algemiene lineêre model (GLM) (kommando "glm", R-pakket "lme4" 57). Normaliteit en homoscedasticity waarden befêstige mei help fan de Shapiro test (kommando "shapiro.test", R pakket "stats" 56) en analyze fan gegevens fariânsje (kommando betadisper, R pakket "vegan" 58). Nei pearwize analyze fan signifikante p-wearden (p <0.05) fan 'e LM- as GLM-test, waarden signifikante ferskillen tusken groepen ûntdutsen mei de EMM-test (kommando "emmeans", R-pakket "emmeans" 59).
De folsleine FA-spektra waarden fergelike mei multivariate permutaasje-analyze fan fariânsje (dus permMANOVA; kommando "adonis2", R-pakket "vegan" 58) mei de Euklidyske ôfstânsmatrix en 999 permutaasjes. Dit helpt by it identifisearjen fan fatty soeren dy't beynfloede wurde troch de aard fan dieet koalhydraten. Signifikante ferskillen yn 'e FA-profilen waarden fierder analysearre mei pearwize fergelikingen. De gegevens waarden dan fisualisearre mei help fan haadkomponintanalyse (PCA) (kommando "PCA", R-pakket "FactoMineR" 60). De FA ferantwurdlik foar dizze ferskillen waard identifisearre troch ynterpretaasje fan de korrelaasjesirkels. Dizze kandidaten waarden befêstige mei in ien-wei analyse fan fariânsje (ANOVA) (kommando "aov", R pakket "stats" 56) folge troch Tukey syn post hoc test (kommando TukeyHSD, R pakket "stats" 56 ). Foardat analyse waard normaliteit beoardiele mei de Shapiro-Wilk-test, homoskedasticiteit waard kontrolearre mei de Bartlett-test (kommando "bartlett.test", R-pakket "stats" 56), en in net-parametryske metoade waard brûkt as net ien fan 'e twa oannames foldien waard . Analysen waarden fergelike (kommando "kruskal.test", R pakket "stats" 56), en dan Dunn syn post hoc tests waarden tapast (kommando dunn.test, R pakket "dunn.test" 56).
De definitive ferzje fan it manuskript waard kontrolearre mei Grammarly Editor as in Ingelske proofreader (Grammarly Inc., San Francisco, California, USA) 61 .
De datasets generearre en analysearre tidens de hjoeddeistige stúdzje binne beskikber fan 'e korrespondearjende auteur op ridlik fersyk.
Kim, SW, et al. Meitsje de wrâldwide fraach nei feedprotein: útdagings, kânsen en strategyen. Annals of Animal Biosciences 7, 221-243 (2019).
Caparros Megido, R., et al. Oersjoch fan 'e status en perspektiven fan' e wrâldproduksje fan ytbere ynsekten. Entomol. Gen. 44, (2024).
Rehman, K. ur, et al. Swarte soldaat fly (Hermetia illucens) as in potinsjeel ynnovatyf en miljeufreonlik ark foar organysk ôffal behear: In koarte resinsje. Waste Management Undersyk 41, 81-97 (2023).
Skala, A., et al. Rearing substraat beynfloedet groei en makronutrient status fan yndustrieel produsearre swarte soldaat fly larven. Sci. Rep. 10, 19448 (2020).
Shu, MK, et al. Antimikrobiële eigenskippen fan oalje-ekstrakten fan swarte soldaatflylarven grutbrocht op brea. Animal Food Science, 64, (2024).
Schmitt, E. en de Vries, W. (2020). Potinsjele foardielen fan it brûken fan swarte soldaat fly dong as boaiem amendemint foar iten produksje en fermindere miljeu-ynfloed. Aktuele miening. Griene Sustain. 25, 100335 (2020).
Franco A. et al. Swarte soldaat fleane lipiden - in ynnovative en duorsume boarne. Duorsume ûntwikkeling, Vol. 13, (2021).
Van Huis, A. Insects as food and feed, an emerging field in agriculture: a review. J. Insect Feed 6, 27-44 (2020).
Kachor, M., Bulak, P., Prots-Petrikha, K., Kirichenko-Babko, M., en Beganovsky, A. Ferskate gebrûk fan swarte soldaat fleane yn yndustry en lânbou - in resinsje. Biology 12, (2023).
Hock, B., Noel, G., Carpentier, J., Francis, F., en Caparros Megido, R. Optimalisaasje fan keunstmjittige propagaasje fan Hermetia illucens. PLOS ONE 14, (2019).
Post tiid: Dec-25-2024