Hvala što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje rezultate preporučujemo korištenje novijeg preglednika (ili isključivanje načina rada kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Crna vojnička muha (Hermetia illucens, L. 1758) je svejedi detritivorni kukac s velikim potencijalom iskorištavanja organskih nusproizvoda bogatih ugljikohidratima. Među ugljikohidratima, crne vojničke muhe oslanjaju se na topive šećere za rast i sintezu lipida. Cilj ove studije bio je procijeniti učinke uobičajenih topivih šećera na razvoj, preživljavanje i profil masnih kiselina crnih vojničkih muha. Hranu za piliće dodajte zasebno monosaharidima i disaharidima. Celuloza je korištena kao kontrola. Larve hranjene glukozom, fruktozom, saharozom i maltozom rasle su brže od kontrolnih ličinki. Nasuprot tome, laktoza je imala antinutritivni učinak na ličinke, usporavajući rast i smanjujući konačnu tjelesnu težinu pojedinca. Međutim, svi topivi šećeri učinili su ličinke debljima od onih hranjenih kontrolnom hranom. Značajno je da su testirani šećeri oblikovali profil masnih kiselina. Maltoza i saharoza povećale su sadržaj zasićenih masnih kiselina u usporedbi s celulozom. Nasuprot tome, laktoza je povećala bioakumulaciju prehrambenih nezasićenih masnih kiselina. Ova studija je prva koja je pokazala učinak topljivog šećera na sastav masnih kiselina ličinki crne vojničke muhe. Naši rezultati pokazuju da ispitivani ugljikohidrati imaju značajan učinak na sastav masnih kiselina ličinki crne vojničke muhe te stoga mogu odrediti njihovu konačnu primjenu.
Globalna potražnja za energijom i životinjskim proteinima nastavlja rasti1. U kontekstu globalnog zatopljenja, imperativ je pronaći zelenije alternative fosilnoj energiji i tradicionalnim metodama proizvodnje hrane uz povećanje proizvodnje. Kukci su obećavajući kandidati za rješavanje ovih problema zbog nižeg kemijskog sastava i utjecaja na okoliš u usporedbi s tradicionalnim uzgojem stoke2. Među kukcima, odličan kandidat za rješavanje ovih problema je crna vojnička muha (BSF), Hermetia illucens (L. 1758), detritivorna vrsta sposobna hraniti se različitim organskim supstratima3. Stoga bi valorizacija ovih supstrata kroz uzgoj BSF mogla stvoriti novi izvor sirovina za zadovoljenje potreba raznih industrija.
Larve BSF-a (BSFL) mogu se hraniti poljoprivrednim i agroindustrijskim nusproizvodima kao što su pivarsko žito, biljni ostaci, voćna pulpa i stari kruh, koji su posebno pogodni za rast BSFL-a zbog visokog sadržaja ugljikohidrata (CH)4,5, 6 sadržaj. Proizvodnja BSFL-a u velikim razmjerima rezultira stvaranjem dva proizvoda: izmeta, mješavine ostataka supstrata i izmeta koji se može koristiti kao gnojivo za uzgoj biljaka7, te ličinki, koje se uglavnom sastoje od proteina, lipida i hitina. Proteini i lipidi uglavnom se koriste u uzgoju stoke, biogorivu i kozmetici8,9. Što se tiče hitina, ovaj biopolimer nalazi primjenu u poljoprivredno-prehrambenom sektoru, biotehnologiji i zdravstvu10.
BSF je autogeni holometabolni kukac, što znači da se njegova metamorfoza i reprodukcija, posebno faze životnog ciklusa kukca koji troše energiju, mogu u potpunosti podržati rezervama hranjivih tvari koje se stvaraju tijekom rasta ličinki11. Točnije, sinteza proteina i lipida dovodi do razvoja masnog tijela, važnog organa za skladištenje koji oslobađa energiju tijekom faza nehranjenja BSF-a: predkukuljice (tj. posljednjeg stadija ličinke tijekom kojeg ličinke BSF-a pocrne tijekom hranjenja i traženja za okoliš pogodan za metamorfozu), kukuljice (tj. stadij koji se ne kreće tijekom kojega kukac prolazi kroz metamorfozu) i odrasli12,13. CH je glavni izvor energije u prehrani BSF14. Među tim nutrijentima, vlaknasti CH kao što su hemiceluloza, celuloza i lignin, za razliku od disaharida i polisaharida (kao što je škrob), BSFL ne može probaviti15,16. Probava CH važan je preliminarni korak za apsorpciju ugljikohidrata, koji se na kraju hidroliziraju u jednostavne šećere u crijevima16. Jednostavni šećeri tada se mogu apsorbirati (tj. kroz intestinalnu peritrofičnu membranu) i metabolizirati za proizvodnju energije17. Kao što je gore spomenuto, ličinke pohranjuju višak energije kao lipide u masnom tijelu12,18. Lipidi za pohranu sastoje se od triglicerida (neutralnih lipida formiranih od jedne molekule glicerola i tri masne kiseline) koje sintetiziraju ličinke iz jednostavnih šećera unesenih hranom. Ovi CH osiguravaju supstrate acetil-CoA potrebne za biosintezu masnih kiselina (FA) putem puteva sintaze masnih kiselina i tioesteraze19. Profilom masnih kiselina lipida H. illucens prirodno dominiraju zasićene masne kiseline (SFA) s visokim udjelom laurinske kiseline (C12:0)19,20. Stoga visok sadržaj lipida i sastav masnih kiselina brzo postaju ograničavajući čimbenici za upotrebu cijelih ličinki u hrani za životinje, posebno u akvakulturi gdje su potrebne višestruko nezasićene masne kiseline (PUFA)21.
Od otkrića potencijala BSFL-a za smanjenje organskog otpada, studije o vrijednosti različitih nusproizvoda pokazale su da je sastav BSFL-a djelomično reguliran njegovom prehranom. Trenutačno se reguliranje FA profila H. illucens nastavlja poboljšavati. Sposobnost BSFL-a da bioakumulira PUFA dokazana je na supstratima bogatim PUFA kao što su alge, riblji otpaci ili brašno kao što je laneno sjeme, što daje profil FA više kvalitete za prehranu životinja19,22,23. Nasuprot tome, za nusproizvode koji nisu obogaćeni PUFA, ne postoji uvijek korelacija između prehrambenih profila masnih kiselina i masnih kiselina ličinki, što ukazuje na utjecaj drugih hranjivih tvari24,25. Zapravo, učinak probavljivog CH na profile FA ostaje slabo shvaćen i nedovoljno istražen24,25,26,27.
Koliko znamo, iako su ukupni monosaharidi i disaharidi u izobilju u prehrani H. illucens, njihova nutritivna uloga ostaje nedovoljno poznata u prehrani H. illucens. Cilj ove studije bio je razjasniti njihove učinke na BSFL prehranu i sastav lipida. Procijenit ćemo rast, preživljavanje i produktivnost ličinki u različitim prehrambenim uvjetima. Zatim ćemo opisati sadržaj lipida i profil masnih kiselina svake dijete kako bismo istaknuli učinke CH na nutritivnu kvalitetu BSFL-a.
Pretpostavili smo da bi priroda testiranog CH utjecala na (1) rast ličinki, (2) ukupne razine lipida i (3) modulirao profil FA. Monosaharidi se mogu apsorbirati izravno, dok se disaharidi moraju hidrolizirati. Monosaharidi su stoga dostupniji kao izravni izvori energije ili prekursori za lipogenezu putem puteva FA sintaze i tioesteraze, čime se pospješuje rast ličinki H. illucens i potiče nakupljanje rezervnih lipida (osobito laurinske kiseline).
Ispitivani CH utjecao je na prosječnu tjelesnu masu ličinki tijekom rasta (slika 1). FRU, GLU, SUC i MAL povećali su tjelesnu težinu ličinki slično kontrolnoj prehrani (CEL). Nasuprot tome, čini se da LAC i GAL usporavaju razvoj ličinki. Značajno je da je LAC imao značajan negativan učinak na rast ličinki u usporedbi s SUC-om tijekom cijelog razdoblja rasta: 9,16 ± 1,10 mg naspram 15,00 ± 1,01 mg 3. dana (F6,21 = 12,77, p < 0,001; slika 1), 125,11 ± 4,26 mg i 211,79 ± 14,93 mg, odnosno 17. dana (F6,21 = 38,57, p < 0,001; slika 1).
Koristeći različite monosaharide (fruktozu (FRU), galaktozu (GAL), glukozu (GLU)), disaharide (laktozu (LAC), maltozu (MAL), saharozu (SUC)) i celulozu (CEL) kao kontrole. Rast ličinki hranjenih ličinkama crne vojničke muhe. Svaka točka na krivulji predstavlja srednju pojedinačnu težinu (mg) izračunatu vaganjem 20 nasumično odabranih ličinki iz populacije od 100 ličinki (n = 4). Trake pogrešaka predstavljaju SD.
CEL prehrana omogućila je izvrsno preživljavanje ličinki od 95,5 ± 3,8%. Štoviše, smanjeno je preživljavanje H. illucens hranjenih dijetama koje sadrže topljivi CH (GLM: χ = 107,13, df = 21, p < 0,001), što je uzrokovano MAL-om i SUC-om (disaharidi) u proučavanom CH. Smrtnost je bila niža nego kod GLU, FRU, GAL (monosaharida) i LAC (EMM: p < 0,001, slika 2).
Okvirni dijagram preživljavanja ličinki crne vojničke muhe tretiranih različitim monosaharidima (fruktoza, galaktoza, glukoza), disaharidima (laktoza, maltoza, saharoza) i celulozom kao kontrolama. Tretmani s istim slovom ne razlikuju se značajno jedni od drugih (EMM, p > 0,05).
Svi ispitani načini ishrane omogućili su ličinkama da dosegnu predkukuljični stadij. Međutim, testirani CH-ovi imali su tendenciju produljenja razvoja ličinki (F6,21=9,60, p<0,001; Tablica 1). Konkretno, ličinkama hranjenim GAL-om i LAC-om trebalo je više vremena da dođu do predkukuljenog stadija u usporedbi s ličinkama uzgojenim na CEL-u (CEL-GAL: p<0,001; CEL-LAC: p<0,001; Tablica 1).
Testirani CH također je imao različite učinke na tjelesnu masu ličinki, pri čemu je tjelesna težina ličinki hranjenih CEL hranom dosegla 180,19 ± 11,35 mg (F6,21 = 16,86, p < 0,001; slika 3). FRU, GLU, MAL i SUC rezultirali su prosječnom konačnom tjelesnom težinom ličinke većom od 200 mg, što je bilo značajno više od one za CEL (p < 0,05). Nasuprot tome, ličinke hranjene GAL-om i LAC-om imale su nižu tjelesnu težinu, u prosjeku 177,64 ± 4,23 mg odnosno 156,30 ± 2,59 mg (p < 0,05). Taj je učinak bio izraženiji s LAC-om, gdje je konačna tjelesna težina bila niža nego s kontrolnom prehranom (CEL-LAC: razlika = 23,89 mg; p = 0,03; Slika 3).
Srednja konačna težina pojedinačnih ličinki izražena kao mrlje ličinki (mg) i crnih vojničkih muha izražena kao histogram (g) hranjenih različitim monosaharidima (fruktoza, galaktoza, glukoza), disaharidima (laktoza, maltoza, saharoza) i celulozom (kao kontrola). Slova u stupcu predstavljaju skupine koje se značajno razlikuju u ukupnoj masi ličinki (p < 0,001). Slova povezana s mrljama ličinki predstavljaju skupine sa značajno različitim težinama pojedinačnih ličinki (p < 0,001). Trake pogrešaka predstavljaju SD.
Maksimalna pojedinačna težina bila je neovisna o maksimalnoj konačnoj ukupnoj težini kolonije ličinki. U stvari, dijete koje sadrže FRU, GLU, MAL i SUC nisu povećale ukupnu težinu ličinki proizvedenih u spremniku u usporedbi s CEL (Slika 3). Međutim, LAC je značajno smanjio ukupnu težinu (CEL-LAC: razlika = 9,14 g; p < 0,001; Slika 3).
Tablica 1 prikazuje prinos (ličinke/dan). Zanimljivo je da su optimalni prinosi CEL, MAL i SUC bili slični (Tablica 1). Nasuprot tome, FRU, GAL, GLU i LAC smanjili su prinos u usporedbi s CEL (Tablica 1). Najgore su se pokazali GAL i LAC: prinos je prepolovljen na samo 0,51 ± 0,09 g ličinki/dan odnosno 0,48 ± 0,06 g ličinki/dan (tablica 1).
Monosaharidi i disaharidi povećali su sadržaj lipida u ličinkama CF (Tablica 1). Na CLE dijeti dobivene su ličinke s udjelom lipida od 23,19 ± 0,70% udjela suhe tvari. Usporedbe radi, prosječni sadržaj lipida u ličinki hranjenih topivim šećerom iznosio je više od 30% (Tablica 1). Međutim, testirani CH-i su u istoj mjeri povećali sadržaj masti.
Kao što se očekivalo, CG subjekti utjecali su na FA profil ličinki u različitim stupnjevima (slika 4). Sadržaj SFA bio je visok u svim dijetama i dosezao je više od 60%. MAL i SUC su neuravnotežili profil FA, što je dovelo do povećanja sadržaja SFA. U slučaju MAL-a, s jedne strane, ta je neravnoteža dovela pretežno do smanjenja udjela mononezasićenih masnih kiselina (MUFA) (F6,21 = 7,47; p < 0,001; sl. 4). S druge strane, za SUC, smanjenje je bilo ravnomjernije između MUFA i PUFA. LAC i MAL imali su suprotne učinke na FA spektar (SFA: F6,21 = 8,74; p < 0,001; MUFA: F6,21 = 7,47; p < 0,001; PUFA: χ2 = 19,60; Df = 6; p < 0,001; Slika 4). Čini se da niži udio SFA u ličinkama hranjenim LAC-om povećava sadržaj MUFA. Konkretno, razine MUFA bile su više kod ličinki hranjenih LAC-om u usporedbi s drugim topivim šećerima osim za GAL (F6,21 = 7,47; p < 0,001; Slika 4).
Koristeći različite monosaharide (fruktozu (FRU), galaktozu (GAL), glukozu (GLU)), disaharide (laktozu (LAC), maltozu (MAL), saharozu (SUC)) i celulozu (CEL) kao kontrole, okvirni dijagram masnih kiselina sastav hranjen ličinkama crne vojničke muhe. Rezultati su izraženi kao postotak ukupne FAME. Tretmani označeni različitim slovima značajno se razlikuju (p < 0,001). (a) Udio zasićenih masnih kiselina; (b) Mononezasićene masne kiseline; (c) Višestruko nezasićene masne kiseline.
Među identificiranim masnim kiselinama u svim promatranim spektrima dominira laurinska kiselina (C12:0) (više od 40%). Druge prisutne SFA bile su palmitinska kiselina (C16:0) (manje od 10%), stearinska kiselina (C18:0) (manje od 2,5%) i kaprinska kiselina (C10:0) (manje od 1,5%). MUFA su uglavnom zastupljene oleinskom kiselinom (C18:1n9) (manje od 9,5%), dok su PUFA uglavnom sastavljene od linolne kiseline (C18:2n6) (manje od 13,0%) (vidi dodatnu tablicu S1). Osim toga, mali udio spojeva nije se mogao identificirati, posebno u spektrima CEL ličinki, gdje je neidentificirani spoj broj 9 (UND9) činio prosječno 2,46 ± 0,52% (vidi dodatnu tablicu S1). GC × GC-FID analiza sugerira da bi to mogla biti masna kiselina s 20 ugljika s pet ili šest dvostrukih veza (vidi dodatnu sliku S5).
Analiza PERMANOVA otkrila je tri različite skupine na temelju profila masnih kiselina (F6,21 = 7,79, p < 0,001; Slika 5). Analiza glavnih komponenti (PCA) TBC spektra to ilustrira i objašnjava dvije komponente (Slika 5). Glavne komponente objasnile su 57,9% varijance i uključivale su, prema redu važnosti, laurinsku kiselinu (C12:0), oleinsku kiselinu (C18:1n9), palmitinsku kiselinu (C16:0), stearinsku kiselinu (C18:0) i linolenska kiselina (C18:3n3) (vidi sliku S4). Druga komponenta je objasnila 26,3% varijance i uključivala je, redoslijedom važnosti, dekansku kiselinu (C10:0) i linolnu kiselinu (C18:2n6 cis) (vidi dodatnu sliku S4). Profili prehrane s jednostavnim šećerima (FRU, GAL i GLU) pokazali su slične karakteristike. Nasuprot tome, disaharidi su dali različite profile: MAL i SUC s jedne strane i LAC s druge strane. Konkretno, MAL je bio jedini šećer koji je promijenio profil FA u usporedbi s CEL. Osim toga, MAL profil se značajno razlikovao od FRU i GLU profila. Konkretno, profil MAL pokazao je najveći udio C12:0 (54,59 ± 2,17%), što ga čini usporedivim s CEL (43,10 ± 5,01%), LAC (43,35 ± 1,31%), FRU (48,90 ± 1,97%) i GLU (48,38 ± 2,17%) profili (vidi dodatnu tablicu S1). MAL spektar također je pokazao najniži sadržaj C18:1n9 (9,52 ± 0,50%), što ga je dodatno razlikovalo od LAC (12,86 ± 0,52%) i CEL (12,40 ± 1,31%) spektra. Sličan trend uočen je za C16:0. U drugoj komponenti, LAC spektar je pokazao najveći sadržaj C18:2n6 (17,22 ± 0,46%), dok je MAL pokazao najmanji (12,58 ± 0,67%). C18:2n6 također je razlikovao LAC od kontrole (CEL), koja je pokazala niže razine (13,41 ± 2,48%) (vidi dodatnu tablicu S1).
PCA dijagram profila masnih kiselina ličinki crne vojničke muhe s različitim monosaharidima (fruktoza, galaktoza, glukoza), disaharidima (laktoza, maltoza, saharoza) i celulozom kao kontrolom.
Za proučavanje nutritivnih učinaka topivih šećera na ličinke H. illucens, celuloza (CEL) u hrani za piliće zamijenjena je glukozom (GLU), fruktozom (FRU), galaktozom (GAL), maltozom (MAL), saharozom (SUC) i laktoza (LAC). Međutim, monosaharidi i disaharidi imaju različite učinke na razvoj, preživljavanje i sastav ličinki HF-a. Na primjer, GLU, FRU i njihovi disaharidni oblici (MAL i SUC) imali su pozitivne potporne učinke na rast ličinki, što im je omogućilo postizanje veće konačne tjelesne težine od CEL. Za razliku od neprobavljivog CEL-a, GLU, FRU i SUC mogu zaobići crijevnu barijeru i poslužiti kao važni izvori hranjivih tvari u formuliranim dijetama16,28. MAL-u nedostaju specifični životinjski prijenosnici i smatra se da se hidrolizira u dvije molekule glukoze prije asimilacije15. Te su molekule pohranjene u tijelu kukca kao izravan izvor energije ili kao lipidi18. Prvo, s obzirom na potonje, neke od uočenih intramodalnih razlika mogu biti posljedica malih razlika u omjerima spolova. Doista, kod H. illucens reprodukcija može biti potpuno spontana: odrasle ženke prirodno imaju dovoljno rezervi za polaganje jaja i teže su od mužjaka29. Međutim, nakupljanje lipida u BSFL-u korelira s unosom topivog CH2 hranom, kao što je prethodno primijećeno za GLU i ksilozu26,30. Na primjer, Li i sur.30 primijetili su da kada je 8% GLU dodano ishrani ličinki, sadržaj lipida u ličinkama BSF-a povećao se za 7,78% u usporedbi s kontrolama. Naši rezultati su u skladu s ovim opažanjima, pokazujući da je sadržaj masti u ličinkama hranjenim topivim šećerom bio viši nego u ličinkama hranjenim CEL prehranom, u usporedbi s povećanjem od 8,57% s dodatkom GLU. Iznenađujuće, slični rezultati primijećeni su kod ličinki hranjenih GAL i LAC, unatoč štetnim učincima na rast ličinki, konačnu tjelesnu težinu i preživljavanje. Ličinke hranjene LAC-om bile su značajno manje od onih hranjenih CEL dijetom, ali njihov sadržaj masti bio je usporediv s ličinkama hranjenim drugim topivim šećerima. Ovi rezultati naglašavaju antinutritivne učinke laktoze na BSFL. Prvo, prehrana sadrži veliku količinu CH. Sustavi apsorpcije i hidrolize monosaharida odnosno disaharida mogu doći do zasićenja, uzrokujući uska grla u procesu asimilacije. Što se tiče hidrolize, nju provode α- i β-glukozidaze 31 . Ovi enzimi imaju preferirane supstrate ovisno o njihovoj veličini i kemijskim vezama (α ili β vezama) između njihovih sastavnih monosaharida 15 . Hidrolizu LAC u GLU i GAL provodi β-galaktozidaza, enzim čija je aktivnost dokazana u crijevima BSF 32 . Međutim, njegova ekspresija može biti nedovoljna u usporedbi s količinom LAC koju konzumiraju ličinke. Nasuprot tome, α-glukozidaza maltaza i sukraza 15, za koje je poznato da se obilno eksprimiraju u kukcima, mogu razgraditi velike količine MAL i saharoze SUC, čime se ograničava ovaj učinak zasićenja. Drugo, antinutritivni učinci mogu biti posljedica smanjene stimulacije aktivnosti crijevne amilaze insekata i usporavanja ponašanja pri hranjenju u usporedbi s drugim tretmanima. Doista, topljivi šećeri identificirani su kao stimulatori aktivnosti enzima važnih za probavu insekata, kao što je amilaza, i kao okidači odgovora na hranjenje33,34,35. Stupanj stimulacije varira ovisno o molekularnoj strukturi šećera. Zapravo, disaharidi zahtijevaju hidrolizu prije apsorpcije i imaju tendenciju da stimuliraju amilazu više nego njihovi sastavni monosaharidi34. Nasuprot tome, LAC ima blaži učinak i utvrđeno je da nije sposoban podržati rast insekata kod raznih vrsta33,35. Na primjer, kod štetnika Spodoptera exigua (Boddie 1850), nije otkrivena hidrolitička aktivnost LAC u ekstraktima enzima srednjeg crijeva gusjenice36.
Što se tiče FA spektra, naši rezultati ukazuju na značajne modulatorne učinke testiranog CH. Naime, iako je laurinska kiselina (C12:0) činila manje od 1% ukupne masne kiseline u prehrani, dominirala je u svim profilima (vidi dodatnu tablicu S1). Ovo je u skladu s prethodnim podacima da se laurinska kiselina sintetizira iz dijetalnog CH u H. illucens preko puta koji uključuje acetil-CoA karboksilazu i FA sintazu19,27,37. Naši rezultati potvrđuju da je CEL uglavnom neprobavljiv i djeluje kao "sredstvo za povećanje volumena" u dijetama za kontrolu BSF-a, kao što je objašnjeno u nekoliko studija BSFL-a38,39,40. Zamjena CEL s monosaharidima i disaharidima osim LAC povećala je omjer C12:0, što ukazuje na povećani unos CH od strane ličinki. Zanimljivo je da disaharidi MAL i SUC pospješuju sintezu laurinske kiseline učinkovitije nego njihovi sastavni monosaharidi, što sugerira da unatoč višem stupnju polimerizacije GLU i FRU, a budući da je Drosophila jedini prijenosnik saharoze koji je identificiran u vrstama životinjskih proteina, prijenosnici disaharida možda neće biti prisutan u crijevima ličinki H. illucens15, korištenje GLU a FRU je povećan. Međutim, iako se GLU i FRU teoretski lakše metaboliziraju pomoću BSF-a, također ih lakše metaboliziraju supstrati i crijevni mikroorganizmi, što može rezultirati njihovom bržom razgradnjom i smanjenom upotrebom od strane ličinki u usporedbi s disaharidi.
Na prvi pogled, sadržaj lipida ličinki hranjenih LAC i MAL bio je usporediv, što ukazuje na sličnu bioraspoloživost ovih šećera. Međutim, iznenađujuće, FA profil LAC bio je bogatiji SFA, posebno s nižim sadržajem C12:0, u usporedbi s MAL. Jedna od hipoteza koja objašnjava ovu razliku je da LAC može stimulirati bioakumulaciju prehrambenih FA putem acetil-CoA FA sintaze. Podržavajući ovu hipotezu, ličinke LAC imale su najniži omjer dekanoata (C10:0) (0,77 ± 0,13%) nego CEL prehrana (1,27 ± 0,16%), što ukazuje na smanjenu aktivnost FA sintaze i tioesteraze19. Drugo, prehrambene masne kiseline smatraju se glavnim faktorom koji utječe na sastav SFA H. illucens27. U našim pokusima linolna kiselina (C18:2n6) činila je 54,81% masnih kiselina u prehrani, s udjelom u ličinkama LAC 17,22 ± 0,46% i u MAL 12,58 ± 0,67%. Oleinska kiselina (cis + trans C18:1n9) (23,22% u prehrani) pokazala je sličan trend. Omjer α-linolenske kiseline (C18:3n3) također podržava hipotezu o bioakumulaciji. Poznato je da se ova masna kiselina nakuplja u BSFL-u nakon obogaćivanja supstrata, kao što je dodatak lanenog kolača, do 6-9% ukupnih masnih kiselina u ličinkama19. U obogaćenoj prehrani, C18:3n3 može činiti do 35% ukupnih masnih kiselina u prehrani. Međutim, u našem istraživanju, C18:3n3 čini samo 2,51% profila masnih kiselina. Iako je udio pronađen u prirodi bio niži u našim ličinkama, taj je udio bio veći u ličinkama LAC (0,87 ± 0,02%) nego u MAL (0,49 ± 0,04%) (p <0,001; vidi dodatnu tablicu S1). CEL dijeta imala je srednji udio od 0,72 ± 0,18%. Konačno, omjer palmitinske kiseline (C16:0) u ličinkama CF-a odražava doprinos sintetskih putova i prehrambene FA19. Hoc i sur. 19 primijetili su da je sinteza C16:0 smanjena kada je prehrana obogaćena brašnom od sjemenki lana, što se pripisuje smanjenju dostupnosti supstrata acetil-CoA zbog smanjenja omjera CH. Iznenađujuće, iako su obje dijete imale sličan sadržaj CH i MAL je pokazao veću bioraspoloživost, MAL ličinke su pokazale najniži omjer C16:0 (10,46 ± 0,77%), dok je LAC pokazao veći udio, što iznosi 12,85 ± 0,27% (p < 0,05; vidi Dodatna tablica S1). Ovi rezultati naglašavaju kompleksan utjecaj hranjivih tvari na probavu i metabolizam BSFL-a. Trenutno su istraživanja na ovu temu temeljitija kod Lepidoptera nego kod Diptera. Kod gusjenica, LAC je identificiran kao slab stimulans prehrambenog ponašanja u usporedbi s drugim topivim šećerima kao što su SUC i FRU34,35. Konkretno, kod Spodopteralittoralis (Boisduval 1833), konzumacija MAL-a stimulirala je amilolitičku aktivnost u crijevima u većoj mjeri nego LAC34. Slični učinci u BSFL-u mogu objasniti pojačanu stimulaciju C12:0 sintetskog puta u MAL ličinkama, što je povezano s povećanom intestinalno apsorbiranom CH, produljenim hranjenjem i djelovanjem intestinalne amilaze. Manja stimulacija ritma hranjenja u prisutnosti LAC-a također može objasniti sporiji rast ličinki LAC-a. Štoviše, Liu Yanxia et al. 27 primijetio je da je rok trajanja lipida u supstratima H. illucens bio dulji nego kod CH. Stoga se LAC ličinke mogu više oslanjati na lipide iz hrane kako bi dovršile svoj razvoj, što može povećati njihov konačni sadržaj lipida i modulirati njihov profil masnih kiselina.
Koliko nam je poznato, samo je nekoliko studija testiralo učinke dodavanja monosaharida i disaharida BSF dijeti na njihove FA profile. Prvo, Li et al. 30 procijenili su učinke GLU-a i ksiloze i promatrali razine lipida slične našima pri stopi dodavanja od 8%. Profil FA nije bio detaljan i sastojao se uglavnom od SFA, ali nisu pronađene razlike između dva šećera ili kada su prikazani istovremeno30. Nadalje, Cohn i sur. 41 nije pokazao učinak dodavanja 20% GLU, SUC, FRU i GAL hrani za piliće na odgovarajuće FA profile. Ovi spektri dobiveni su iz tehničkih, a ne bioloških replika, što, kako su objasnili autori, može ograničiti statističku analizu. Nadalje, nedostatak kontrole izo-šećera (koristeći CEL) ograničava tumačenje rezultata. Nedavno su dvije studije Nugroho RA i sur. pokazao anomalije u FA spektrima42,43. U prvoj studiji, Nugroho RA i sur. 43 testirali su učinak dodavanja FRU u fermentirano brašno palminih koštica. FA profil dobivenih ličinki pokazao je abnormalno visoke razine PUFA, od kojih je više od 90% potjecalo iz prehrane koja je sadržavala 10% FRU (slično našoj studiji). Iako je ova prehrana sadržavala riblje pelete bogate PUFA, prijavljene vrijednosti FA profila ličinki na kontrolnoj prehrani koja se sastojala od 100% fermentiranog PCM-a nisu bile u skladu s bilo kojim prethodno prijavljenim profilom, posebice abnormalnom razinom C18:3n3 od 17,77. ± 1,67% i 26,08 ± 0,20% za konjugiranu linolnu kiselinu (C18:2n6t), rijedak izomer linolne kiseline. Druga studija pokazala je slične rezultate uključujući FRU, GLU, MAL i SUC42 u fermentiranom obroku palminih koštica. Ove studije, kao i naše, naglašavaju ozbiljne poteškoće u usporedbi rezultata ispitivanja prehrane ličinkama BSF-a, kao što su izbor kontrole, interakcije s drugim izvorima hranjivih tvari i metode analize FA.
Tijekom pokusa primijetili smo da boja i miris supstrata variraju ovisno o korištenoj prehrani. Ovo sugerira da mikroorganizmi mogu igrati ulogu u rezultatima opaženim u supstratu i probavnom sustavu ličinki. Zapravo, monosaharidi i disaharidi se lako metaboliziraju kolonizirajućim mikroorganizmima. Brza potrošnja topivih šećera od strane mikroorganizama može rezultirati oslobađanjem velikih količina mikrobnih metaboličkih produkata kao što su etanol, mliječna kiselina, kratkolančane masne kiseline (npr. octena kiselina, propionska kiselina, maslačna kiselina) i ugljični dioksid44. Neki od ovih spojeva mogu biti odgovorni za smrtonosne toksične učinke na ličinke koje su također uočili Cohn i sur.41 u sličnim razvojnim uvjetima. Na primjer, etanol je štetan za insekte45. Velike količine emisije ugljičnog dioksida mogu dovesti do njegovog nakupljanja na dnu spremnika, što može lišiti atmosferu kisika ako cirkulacija zraka ne dopušta njegovo oslobađanje. Što se tiče SCFA, njihovi učinci na insekte, posebno H. illucens, ostaju nedovoljno poznati, iako se pokazalo da su mliječna kiselina, propionska kiselina i maslačna kiselina smrtonosne kod Callosobruchus maculatus (Fabricius 1775)46. U Drosophila melanogaster Meigen 1830, ove SCFA su olfaktorni markeri koji vode ženke do mjesta za polaganje jaja, što ukazuje na korisnu ulogu u razvoju ličinki47. Međutim, octena kiselina je klasificirana kao opasna tvar i može značajno inhibirati razvoj ličinki47. Nasuprot tome, nedavno je otkriveno da laktat dobiven iz mikroba ima zaštitni učinak protiv invazivnih crijevnih mikroba kod Drosophile48. Nadalje, mikroorganizmi u probavnom sustavu također igraju ulogu u probavi CH kod insekata49. Fiziološki učinci SCFA na crijevnu mikrobiotu, poput brzine hranjenja i ekspresije gena, opisani su kod kralješnjaka 50 . Oni također mogu imati trofički učinak na ličinke H. illucens i mogu djelomično doprinijeti regulaciji FA profila. Studije o nutritivnim učincima ovih proizvoda mikrobne fermentacije razjasnit će njihove učinke na prehranu H. illucens i pružiti osnovu za buduće studije o korisnim ili štetnim mikroorganizmima u smislu njihovog razvoja i vrijednosti supstrata bogatih FA. U tom se smislu sve više proučava uloga mikroorganizama u probavnim procesima masovno uzgojenih kukaca. Insekti se počinju promatrati kao bioreaktori, koji osiguravaju pH i uvjete oksigenacije koji olakšavaju razvoj mikroorganizama specijaliziranih za razgradnju ili detoksikaciju hranjivih tvari koje kukci teško probavljaju 51 . Nedavno su Xiang i sur.52 pokazali da, na primjer, inokulacija organskog otpada mješavinom bakterija omogućuje CF-u da privuče bakterije specijalizirane za razgradnju lignoceluloze, poboljšavajući njenu razgradnju u supstratu u usporedbi sa supstratima bez ličinki.
Konačno, s obzirom na korisnu upotrebu organskog otpada od strane H. illucens, CEL i SUC dijete proizvele su najveći broj ličinki dnevno. To znači da je unatoč nižoj konačnoj težini pojedinačnih jedinki, ukupna težina ličinki proizvedena na supstratu koji se sastoji od neprobavljivog CH usporediva s onom dobivenom na homosaharidnoj dijeti koja sadrži monosaharide i disaharide. U našoj studiji važno je napomenuti da su razine drugih hranjivih tvari dovoljne da podrže rast populacije ličinki i da bi dodavanje CEL-a trebalo biti ograničeno. Međutim, konačni sastav ličinki se razlikuje, što naglašava važnost odabira prave strategije za valorizaciju insekata. CEL ličinke hranjene cjelovitom hranom prikladnije su za upotrebu kao stočna hrana zbog nižeg udjela masti i nižih razina laurinske kiseline, dok ličinke hranjene SUC ili MAL dijetama zahtijevaju odmašćivanje prešanjem kako bi se povećala vrijednost ulja, posebno u biogorivu. sektor. LAC se nalazi u nusproizvodima mliječne industrije kao što je sirutka iz proizvodnje sira. Nedavno je njegova uporaba (3,5% laktoze) poboljšala konačnu tjelesnu težinu ličinki53. Međutim, kontrolna dijeta u ovoj studiji sadržavala je upola manji sadržaj lipida. Stoga su antinutritivni učinci LAC-a možda bili poništeni bioakumulacijom prehrambenih lipida u ličinkama.
Kao što su pokazala prethodna istraživanja, svojstva monosaharida i disaharida značajno utječu na rast BSFL-a i moduliraju njegov FA profil. Konkretno, čini se da LAC igra antinutritivnu ulogu tijekom razvoja ličinki ograničavajući dostupnost CH za apsorpciju lipida iz hrane, čime se potiče bioakumulacija UFA. U tom kontekstu, bilo bi zanimljivo provesti biološke testove koristeći dijete koje kombiniraju PUFA i LAC. Nadalje, uloga mikroorganizama, posebno uloga mikrobnih metabolita (kao što su SCFA) koji potječu od procesa fermentacije šećera, ostaje istraživačka tema vrijedna istraživanja.
Kukci su dobiveni iz BSF kolonije Laboratorija za funkcionalnu i evolucijsku entomologiju osnovanog 2017. u Agro-Bio Techu, Gembloux, Belgija (za više pojedinosti o metodama uzgoja, vidi Hoc et al. 19). Za eksperimentalne pokuse, 2,0 g BSF jaja je nasumično skupljano dnevno iz kaveza za uzgoj i inkubirano u 2,0 kg 70% mokre hrane za piliće (Aveve, Leuven, Belgija). Pet dana nakon izlijeganja, ličinke su odvojene od supstrata i ručno prebrojane u eksperimentalne svrhe. Izmjerena je početna težina svake serije. Prosječna pojedinačna težina bila je 7,125 ± 0,41 mg, a prosjek za svaki tretman prikazan je u Dodatnoj tablici S2.
Formula prehrane prilagođena je studiji Barragan-Fonseca i sur. 38 . Ukratko, pronađen je kompromis između iste kvalitete hrane za piliće s ličinkama, sličnog sadržaja suhe tvari (DM), visokog CH (10% temeljeno na svježoj hrani) i teksture, budući da jednostavni šećeri i disaharidi nemaju teksturalna svojstva. Prema informacijama proizvođača (Chicken Feed, AVEVE, Leuven, Belgija), testirani CH (tj. topljivi šećer) je dodan odvojeno kao autoklavirana vodena otopina (15,9%) u ishranu koja se sastoji od 16,0% proteina, 5,0% ukupnih lipida, 11,9% mljevene hrane za piliće koja se sastoji od pepela i 4,8% vlakana. U svakoj staklenci od 750 ml (17,20 × 11,50 × 6,00 cm, AVA, Tempsee, Belgija), 101,9 g autoklavirane otopine CH pomiješano je s 37,8 g hrane za piliće. Za svaku dijetu sadržaj suhe tvari bio je 37,0%, uključujući homogene proteine (11,7%), homogene lipide (3,7%) i homogene šećere (26,9% dodanog CH). Ispitani CH bili su glukoza (GLU), fruktoza (FRU), galaktoza (GAL), maltoza (MAL), saharoza (SUC) i laktoza (LAC). Kontrolna prehrana sastojala se od celuloze (CEL), koja se smatra neprobavljivom za ličinke H. illucens 38 . Sto petodnevnih ličinki stavljeno je u pladanj s poklopcem s rupom promjera 1 cm u sredini i prekriven plastičnom mrežicom protiv komaraca. Svaka dijeta je ponovljena četiri puta.
Težina ličinki mjerena je tri dana nakon početka pokusa. Za svako mjerenje, 20 ličinki je uklonjeno sa supstrata korištenjem sterilne tople vode i pincete, osušeno i izvagano (STX223, Ohaus Scout, Parsippany, SAD). Nakon vaganja, ličinke su vraćene u središte supstrata. Mjerenja su vršena redovito tri puta tjedno do pojave prve pretkukuljice. U ovom trenutku sakupite, prebrojite i izvažite sve ličinke kao što je prethodno opisano. Odvojite ličinke stadija 6 (tj. bijele ličinke koje odgovaraju stadiju ličinke koji prethodi stadiju pretkukuljice) i pretkukuljice (tj. posljednju fazu ličinke tijekom koje ličinke BSF-a pocrne, prestanu se hraniti i traže okruženje pogodno za metamorfozu) i pohranite na - 18°C za analizu sastava. Prinos je izračunat kao omjer ukupne mase insekata (ličinke i pretkukuljice stadija 6) dobivenih po zdjelici (g) i vremena razvoja (d). Sve srednje vrijednosti u tekstu su izražene kao: srednja vrijednost ± SD.
Svi sljedeći koraci u kojima su korištena otapala (heksan (Hex), kloroform (CHCl3), metanol (MeOH)) izvedeni su pod napom i zahtijevali su nošenje nitrilnih rukavica, pregača i zaštitnih naočala.
Bijele ličinke sušene su u FreeZone6 sušilici zamrzavanjem (Labconco Corp., Kansas City, MO, SAD) 72 h i zatim samljevene (IKA A10, Staufen, Njemačka). Ukupni lipidi ekstrahirani su iz ±1 g praha korištenjem Folch metode 54. Preostali sadržaj vlage svakog liofiliziranog uzorka određen je u duplikatu pomoću analizatora vlage (MA 150, Sartorius, Göttiggen, Njemačka) za korekciju ukupnih lipida.
Ukupni lipidi su transesterificirani u kiselim uvjetima kako bi se dobili metilni esteri masnih kiselina. Ukratko, otprilike 10 mg lipida/100 µl otopine CHCl3 (100 µl) ispareno je s dušikom u Pyrex© cijevi od 8 ml (SciLabware – DWK Life Sciences, London, UK). Epruveta je stavljena u Hex (0,5 ml) (PESTINORM®SUPRATRACE n-Heksan > 95% za analizu organskih tragova, VWR Chemicals, Radnor, PA, SAD) i Hex/MeOH/BF3 (20/25/55) otopinu (0,5 ml) u vodenoj kupelji na 70 °C 90 min. Nakon hlađenja dodane su 10% vodena otopina H2SO4 (0,2 ml) i zasićena otopina NaCl (0,5 ml). Promiješajte epruvetu i napunite smjesu čistim Hexom (8,0 mL). Dio gornje faze prenesen je u bočicu i analiziran plinskom kromatografijom s plameno-ionizacijskim detektorom (GC-FID). Uzorci su analizirani korištenjem Trace GC Ultra (Thermo Scientific, Waltham, MA, SAD) opremljenog split/splitless injektorom (240 °C) u split modu (split flow: 10 mL/min), kolonom Stabilwax®-DA ( 30 m, unutarnji promjer 0,25 mm, 0,25 μm, Restek Corp., Bellefonte, PA, SAD) i FID (250 °C). Program temperature postavljen je na sljedeći način: 50 °C tijekom 1 minute, povećanje do 150 °C pri 30 °C/min, povećanje do 240 °C pri 4 °C/min i nastavak na 240 °C tijekom 5 minuta. Hex je korišten kao slijepa proba, a za identifikaciju je korišten referentni standard koji sadrži 37 metil estera masnih kiselina (Supelco 37-component FAMEmix, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgija). Identifikacija nezasićenih masnih kiselina (UFA) potvrđena je sveobuhvatnom dvodimenzionalnom GC (GC×GC-FID), a prisutnost izomera je točno određena laganom prilagodbom metode Ferrara et al. 55. Pojedinosti o instrumentu mogu se pronaći u Dodatnoj tablici S3, a rezultati u Dodatnoj slici S5.
Podaci su prikazani u formatu Excel proračunske tablice (Microsoft Corporation, Redmond, WA, SAD). Statistička analiza provedena je korištenjem R Studio (verzija 2023.12.1+402, Boston, SAD) 56 . Podaci o težini ličinki, vremenu razvoja i produktivnosti procijenjeni su korištenjem linearnog modela (LM) (naredba "lm", R paket "statistika" 56 ) budući da odgovaraju Gaussovoj distribuciji. Stope preživljenja korištenjem analize binomnog modela procijenjene su korištenjem općeg linearnog modela (GLM) (naredba "glm", R paket "lme4" 57 ). Normalnost i homoskedastičnost potvrđene su Shapiro testom (naredba “shapiro.test”, R paket “stats” 56 ) i analizom varijance podataka (naredba betadisper, R paket “vegan” 58 ). Nakon analize parova značajnih p-vrijednosti (p < 0,05) iz LM ili GLM testa, značajne razlike između skupina otkrivene su pomoću EMM testa (naredba “emmeans”, R paket “emmeans” 59).
Kompletni FA spektri uspoređeni su korištenjem multivarijatne permutacijske analize varijance (tj. permMANOVA; naredba “adonis2”, R paket “vegan” 58) korištenjem Euklidske matrice udaljenosti i 999 permutacija. To pomaže identificirati masne kiseline na koje utječe priroda ugljikohidrata u prehrani. Značajne razlike u FA profilima dalje su analizirane korištenjem parnih usporedbi. Podaci su zatim vizualizirani pomoću analize glavnih komponenti (PCA) (naredba “PCA”, R paket “FactoMineR” 60). FA odgovoran za ove razlike identificiran je interpretacijom korelacijskih krugova. Ti su kandidati potvrđeni korištenjem jednosmjerne analize varijance (ANOVA) (naredba "aov", R paket "statistika" 56 ) praćena Tukeyjevim post hoc testom (naredba TukeyHSD, R paket "statistika" 56 ). Prije analize, normalnost je procijenjena pomoću Shapiro-Wilkovog testa, homoskedastičnost je provjerena pomoću Bartlettovog testa (naredba “bartlett.test”, R paket “stats” 56), a neparametrijska metoda je korištena ako nijedna od dvije pretpostavke nije ispunjena. . Uspoređene su analize (naredba “kruskal.test”, R paket “stats” 56 ), a zatim su primijenjeni Dunnovi post hoc testovi (naredba dunn.test, R paket “dunn.test” 56 ).
Konačna verzija rukopisa provjerena je pomoću Grammarly Editora kao engleskog lektora (Grammarly Inc., San Francisco, Kalifornija, SAD) 61 .
Skupovi podataka generirani i analizirani tijekom trenutne studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Kim, SW, et al. Zadovoljenje globalne potražnje za proteinima stočne hrane: izazovi, prilike i strategije. Annals of Animal Biosciences 7, 221–243 (2019).
Caparros Megido, R., et al. Osvrt na stanje i perspektive svjetske proizvodnje jestivih kukaca. Entomol. Postanak 44, (2024).
Rehman, K. ur, et al. Muha crni vojnik (Hermetia illucens) kao potencijalno inovativan i ekološki prihvatljiv alat za gospodarenje organskim otpadom: Kratak pregled. Istraživanje gospodarenja otpadom 41, 81–97 (2023).
Skala, A. i sur. Uzgojni supstrat utječe na rast i status makronutrijenata industrijski proizvedenih ličinki crne vojničke muhe. Sci. Rep. 10, 19448 (2020).
Shu, MK i sur. Antimikrobna svojstva uljnih ekstrakata iz ličinki crne vojničke muhe uzgojene na krušnim mrvicama. Znanost o hrani za životinje, 64, (2024).
Schmitt, E. i de Vries, W. (2020). Potencijalne prednosti korištenja gnojiva crnog vojnika kao dodatka tlu za proizvodnju hrane i smanjen utjecaj na okoliš. Trenutno mišljenje. Green Sustain. 25, 100335 (2020).
Franco A. i sur. Lipidi muha crnog vojnika—inovativni i održivi izvor. Održivi razvoj, Vol. 13, (2021).
Van Huis, A. Insekti kao hrana i stočna hrana, polje u nastajanju u poljoprivredi: pregled. J. Hrana za kukce 6, 27–44 (2020).
Kachor, M., Bulak, P., Prots-Petrikha, K., Kirichenko-Babko, M., i Beganovsky, A. Razne upotrebe crne vojničke muhe u industriji i poljoprivredi – pregled. Biologija 12, (2023).
Hock, B., Noel, G., Carpentier, J., Francis, F. i Caparros Megido, R. Optimizacija umjetnog razmnožavanja Hermetia illucens. PLOS ONE 14, (2019).
Vrijeme objave: 25. prosinca 2024