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La mosca soldato nera (Hermetia illucens, L. 1758) è un insetto detritivoro onnivoro con un elevato potenziale di utilizzo di sottoprodotti organici ricchi di carboidrati. Tra i carboidrati, le mosche soldato nere fanno affidamento sugli zuccheri solubili per la crescita e la sintesi dei lipidi. Lo scopo di questo studio era di valutare gli effetti dei comuni zuccheri solubili sullo sviluppo, sulla sopravvivenza e sul profilo degli acidi grassi delle mosche soldato nere. Integrare il mangime per polli con monosaccaridi e disaccaridi separatamente. La cellulosa è stata utilizzata come controllo. Le larve alimentate con glucosio, fruttosio, saccarosio e maltosio crescevano più velocemente delle larve di controllo. Al contrario, il lattosio ha avuto un effetto antinutrizionale sulle larve, rallentando la crescita e riducendo il peso corporeo finale dell’individuo. Tuttavia, tutti gli zuccheri solubili hanno reso le larve più grasse rispetto a quelle alimentate con la dieta di controllo. In particolare, gli zuccheri testati hanno modellato il profilo degli acidi grassi. Maltosio e saccarosio hanno aumentato il contenuto di acidi grassi saturi rispetto alla cellulosa. Al contrario, il lattosio ha aumentato il bioaccumulo di acidi grassi insaturi alimentari. Questo studio è il primo a dimostrare l’effetto dello zucchero solubile sulla composizione degli acidi grassi delle larve della mosca soldato nera. I nostri risultati indicano che i carboidrati testati hanno un effetto significativo sulla composizione degli acidi grassi delle larve della mosca soldato nera e possono quindi determinare la loro applicazione finale.
La domanda globale di energia e proteine animali continua ad aumentare1. Nel contesto del riscaldamento globale, è imperativo trovare alternative più ecologiche all’energia fossile e ai metodi tradizionali di produzione alimentare, aumentando al contempo la produzione. Gli insetti sono candidati promettenti per affrontare questi problemi a causa della loro composizione chimica e del loro impatto ambientale inferiori rispetto all’allevamento tradizionale2. Tra gli insetti, un ottimo candidato per affrontare queste problematiche è la mosca soldato nera (BSF), Hermetia illucens (L. 1758), una specie detritivora capace di nutrirsi di una varietà di substrati organici3. Pertanto, la valorizzazione di questi substrati attraverso il miglioramento genetico della BSF potrebbe creare una nuova fonte di materie prime per soddisfare le esigenze di vari settori.
Le larve della BSF (BSFL) possono nutrirsi di sottoprodotti agricoli e agroindustriali come cereali di birra, residui vegetali, polpa di frutta e pane raffermo, che sono particolarmente adatti alla crescita della BSFL a causa del loro alto contenuto di carboidrati (CH)4,5, 6 contenuti. La produzione su larga scala di BSFL porta alla formazione di due prodotti: le feci, una miscela di residui di substrato e feci che può essere utilizzata come fertilizzante per la coltivazione delle piante7, e le larve, composte principalmente da proteine, lipidi e chitina. Proteine e lipidi sono utilizzati principalmente nell'allevamento del bestiame, nei biocarburanti e nei cosmetici8,9. Come per la chitina, questo biopolimero trova applicazioni nel settore agroalimentare, nelle biotecnologie e nella sanità10.
La BSF è un insetto olometabolico autogeno, il che significa che la sua metamorfosi e riproduzione, in particolare le fasi del ciclo vitale dell'insetto che consumano energia, possono essere interamente supportate dalle riserve di nutrienti generate durante la crescita larvale11. Più nello specifico, la sintesi proteica e lipidica porta allo sviluppo del corpo grasso, un importante organo di deposito che rilascia energia durante le fasi di non alimentazione della BSF: la prepupa (ovvero lo stadio larvale finale durante il quale le larve della BSF diventano nere mentre si nutrono e cercano per un ambiente adatto alla metamorfosi), pupe (ovvero lo stadio non mobile durante il quale l'insetto subisce la metamorfosi) e adulti12,13. Il CH è la principale fonte di energia nella dieta di BSF14. Tra questi nutrienti, il CH fibroso come l'emicellulosa, la cellulosa e la lignina, a differenza dei disaccaridi e dei polisaccaridi (come l'amido), non possono essere digeriti dal BSFL15,16. La digestione del CH è un importante passo preliminare per l'assorbimento dei carboidrati, che alla fine vengono idrolizzati in zuccheri semplici nell'intestino16. Gli zuccheri semplici possono poi essere assorbiti (cioè attraverso la membrana peritrofica intestinale) e metabolizzati per produrre energia17. Come accennato in precedenza, le larve immagazzinano l'energia in eccesso sotto forma di lipidi nel grasso corporeo12,18. I lipidi di deposito sono costituiti da trigliceridi (lipidi neutri formati da una molecola di glicerolo e tre acidi grassi) sintetizzati dalle larve a partire dagli zuccheri semplici alimentari. Questi CH forniscono i substrati di acetil-CoA richiesti per la biosintesi degli acidi grassi (FA) attraverso le vie degli acidi grassi sintasi e tioesterasi19. Il profilo degli acidi grassi dei lipidi di H. illucens è naturalmente dominato dagli acidi grassi saturi (SFA) con un'elevata percentuale di acido laurico (C12:0)19,20. Pertanto, l’elevato contenuto lipidico e la composizione in acidi grassi stanno rapidamente diventando fattori limitanti per l’utilizzo di larve intere nell’alimentazione animale, soprattutto in acquacoltura dove sono necessari acidi grassi polinsaturi (PUFA)21.
Dalla scoperta del potenziale del BSFL nella riduzione dei rifiuti organici, gli studi sul valore di vari sottoprodotti hanno dimostrato che la composizione del BSFL è in parte regolata dalla sua dieta. Attualmente, la regolamentazione del profilo FA di H. illucens continua a migliorare. La capacità del BSFL di bioaccumulare PUFA è stata dimostrata su substrati ricchi di PUFA come alghe, scarti di pesce o farine come semi di lino, che forniscono un profilo FA di qualità superiore per l'alimentazione animale19,22,23. Al contrario, per i sottoprodotti che non sono arricchiti in PUFA, non c'è sempre una correlazione tra i profili degli FA nella dieta e gli FA larvali, indicando l'influenza di altri nutrienti24,25. In effetti, l'effetto del CH digeribile sui profili degli FA rimane poco compreso e poco studiato24,25,26,27.
Per quanto ne sappiamo, sebbene i monosaccaridi e i disaccaridi totali siano abbondanti nella dieta di H. illucens, il loro ruolo nutrizionale rimane poco compreso nella nutrizione di H. illucens. Lo scopo di questo studio era di chiarire i loro effetti sulla nutrizione del BSFL e sulla composizione lipidica. Valuteremo la crescita, la sopravvivenza e la produttività delle larve in diverse condizioni nutrizionali. Quindi, descriveremo il contenuto lipidico e il profilo degli acidi grassi di ciascuna dieta per evidenziare gli effetti del CH sulla qualità nutrizionale del BSFL.
Abbiamo ipotizzato che la natura del CH testato avrebbe influenzato (1) la crescita larvale, (2) i livelli lipidici totali e (3) avrebbe modulato il profilo FA. I monosaccaridi possono essere assorbiti direttamente, mentre i disaccaridi devono essere idrolizzati. I monosaccaridi sono quindi più disponibili come fonti di energia diretta o precursori per la lipogenesi attraverso le vie della FA sintasi e della tioesterasi, migliorando così la crescita larvale di H. illucens e promuovendo l'accumulo di lipidi di riserva (in particolare acido laurico).
Il CH testato ha influenzato il peso corporeo medio delle larve durante la crescita (Fig. 1). FRU, GLU, SUC e MAL hanno aumentato il peso corporeo delle larve in modo simile alla dieta di controllo (CEL). Al contrario, LAC e GAL sembravano ritardare lo sviluppo larvale. In particolare, il LAC ha avuto un effetto negativo significativo sulla crescita larvale rispetto al SUC durante tutto il periodo di crescita: 9,16 ± 1,10 mg contro 15,00 ± 1,01 mg il giorno 3 (F6,21 = 12,77, p < 0,001; Fig. 1), 125,11 ± 4,26 mg e 211,79 ± 14,93 mg, rispettivamente, al giorno 17 (F6,21 = 38,57, p < 0,001; Figura 1).
Utilizzando diversi monosaccaridi (fruttosio (FRU), galattosio (GAL), glucosio (GLU)), disaccaridi (lattosio (LAC), maltosio (MAL), saccarosio (SUC)) e cellulosa (CEL) come controlli. Crescita di larve alimentate con larve di mosca soldato nera. Ciascun punto della curva rappresenta il peso individuale medio (mg) calcolato pesando 20 larve selezionate casualmente da una popolazione di 100 larve (n = 4). Le barre di errore rappresentano SD.
La dieta CEL ha fornito un'eccellente sopravvivenza larvale del 95,5 ± 3,8%. Inoltre, la sopravvivenza delle diete alimentate con H. illucens contenenti CH solubile è stata ridotta (GLM: χ = 107,13, df = 21, p <0,001), causata da MAL e SUC (disaccaridi) nel CH studiato. La mortalità era inferiore a quella di GLU, FRU, GAL (monosaccaride) e LAC (EMM: p <0,001, Figura 2).
Diagramma della sopravvivenza delle larve di mosca soldato nera trattate con vari monosaccaridi (fruttosio, galattosio, glucosio), disaccaridi (lattosio, maltosio, saccarosio) e cellulosa come controlli. I trattamenti con la stessa lettera non differiscono significativamente tra loro (EMM, p > 0,05).
Tutte le diete testate hanno consentito alle larve di raggiungere lo stadio prepupale. Tuttavia, i CH testati tendevano a prolungare lo sviluppo larvale (F6,21=9,60, p<0,001; Tabella 1). In particolare, le larve alimentate con GAL e LAC hanno impiegato più tempo per raggiungere lo stadio prepupale rispetto alle larve allevate su CEL (CEL-GAL: p<0,001; CEL-LAC: p<0,001; Tabella 1).
Il CH testato ha avuto effetti diversi anche sul peso corporeo delle larve, con il peso corporeo delle larve alimentate con la dieta CEL che ha raggiunto 180,19 ± 11,35 mg (F6,21 = 16,86, p <0,001; Fig. 3). FRU, GLU, MAL e SUC hanno dato come risultato un peso corporeo finale medio della larva superiore a 200 mg, che era significativamente superiore a quello di CEL (p < 0,05). Al contrario, le larve alimentate con GAL e LAC avevano pesi corporei inferiori, con una media di 177,64 ± 4,23 mg e 156,30 ± 2,59 mg, rispettivamente (p < 0,05). Questo effetto è stato più pronunciato con LAC, dove il peso corporeo finale era inferiore rispetto alla dieta di controllo (CEL-LAC: differenza = 23,89 mg; p = 0,03; Figura 3).
Peso finale medio delle singole larve espresso come macchie larvali (mg) e mosche soldato nere espresse come istogramma (g) alimentate con diversi monosaccaridi (fruttosio, galattosio, glucosio), disaccaridi (lattosio, maltosio, saccarosio) e cellulosa (come controllo). Le lettere colonnari rappresentano gruppi significativamente diversi nel peso larvale totale (p <0,001). Le lettere associate alle macchie larvali rappresentano gruppi con pesi larvali individuali significativamente diversi (p <0,001). Le barre di errore rappresentano SD.
Il peso individuale massimo era indipendente dal peso totale massimo della colonia larvale finale. Infatti, le diete contenenti FRU, GLU, MAL e SUC non hanno aumentato il peso totale delle larve prodotte nella vasca rispetto a CEL (Figura 3). Tuttavia, il LAC ha ridotto significativamente il peso totale (CEL-LAC: differenza = 9,14 g; p <0,001; Figura 3).
La tabella 1 mostra la resa (larve/giorno). È interessante notare che le rese ottimali di CEL, MAL e SUC erano simili (Tabella 1). Al contrario, FRU, GAL, GLU e LAC hanno ridotto la resa rispetto a CEL (Tabella 1). GAL e LAC hanno ottenuto i risultati peggiori: la resa è stata dimezzata a soli 0,51 ± 0,09 g larve/giorno e 0,48 ± 0,06 g larve/giorno, rispettivamente (Tabella 1).
Monosaccaridi e disaccaridi hanno aumentato il contenuto lipidico delle larve CF (Tabella 1). Con la dieta CLE sono state ottenute larve con un contenuto lipidico pari al 23,19 ± 0,70% del contenuto di DM. Per confronto, il contenuto medio di lipidi nelle larve alimentate con zucchero solubile era superiore al 30% (Tabella 1). Tuttavia, i CH testati hanno aumentato il loro contenuto di grassi nella stessa misura.
Come previsto, i soggetti CG hanno influenzato il profilo FA delle larve a vari livelli (Fig. 4). Il contenuto di SFA era elevato in tutte le diete e raggiungeva oltre il 60%. MAL e SUC hanno sbilanciato il profilo FA, portando ad un aumento del contenuto di SFA. Nel caso del MAL, da un lato, questo squilibrio ha portato prevalentemente ad una diminuzione del contenuto di acidi grassi monoinsaturi (MUFA) (F6,21 = 7,47; p < 0,001; Fig. 4). D’altro canto, per i SUC, la diminuzione è stata più uniforme tra MUFA e PUFA. LAC e MAL hanno avuto effetti opposti sullo spettro FA (SFA: F6,21 = 8,74; p < 0,001; MUFA: F6,21 = 7,47; p < 0,001; PUFA: χ2 = 19,60; Df = 6; p < 0,001; Figura 4). La percentuale inferiore di SFA nelle larve alimentate con LAC sembra aumentare il contenuto di MUFA. In particolare, i livelli di MUFA erano più alti nelle larve alimentate con LAC rispetto ad altri zuccheri solubili ad eccezione di GAL (F6,21 = 7,47; p <0,001; Figura 4).
Utilizzando diversi monosaccaridi (fruttosio (FRU), galattosio (GAL), glucosio (GLU)), disaccaridi (lattosio (LAC), maltosio (MAL), saccarosio (SUC)) e cellulosa (CEL) come controlli, box plot degli acidi grassi composizione somministrata alle larve della mosca soldato nera. I risultati sono espressi come percentuale del FAME totale. I trattamenti contrassegnati con lettere diverse sono significativamente diversi (p <0,001). (a) Percentuale di acidi grassi saturi; (b) acidi grassi monoinsaturi; (c) Acidi grassi polinsaturi.
Tra gli acidi grassi identificati, l'acido laurico (C12:0) era dominante in tutti gli spettri osservati (più del 40%). Altri SFA presenti erano acido palmitico (C16:0) (meno del 10%), acido stearico (C18:0) (meno del 2,5%) e acido caprico (C10:0) (meno dell'1,5%). I MUFA erano rappresentati principalmente da acido oleico (C18:1n9) (meno del 9,5%), mentre i PUFA erano principalmente composti da acido linoleico (C18:2n6) (meno del 13,0%) (vedere Tabella Supplementare S1). Inoltre, non è stato possibile identificare una piccola percentuale di composti, soprattutto negli spettri delle larve CEL, dove il composto numero 9 (UND9) non identificato rappresentava una media del 2,46 ± 0,52% (vedere Tabella Supplementare S1). L'analisi GC×GC-FID ha suggerito che potrebbe trattarsi di un acido grasso a 20 atomi di carbonio con cinque o sei doppi legami (vedere Figura supplementare S5).
L'analisi PERMANOVA ha rivelato tre gruppi distinti in base ai profili degli acidi grassi (F6,21 = 7,79, p <0,001; Figura 5). L'analisi delle componenti principali (PCA) dello spettro TBC illustra questo ed è spiegato da due componenti (Figura 5). I componenti principali spiegavano il 57,9% della varianza e includevano, in ordine di importanza, acido laurico (C12:0), acido oleico (C18:1n9), acido palmitico (C16:0), acido stearico (C18:0) e acido linolenico (C18:3n3) (vedere Figura S4). Il secondo componente spiegava il 26,3% della varianza e includeva, in ordine di importanza, acido decanoico (C10: 0) e acido linoleico (C18: 2n6 cis) (vedere Figura supplementare S4). I profili delle diete contenenti zuccheri semplici (FRU, GAL e GLU) hanno mostrato caratteristiche simili. Al contrario, i disaccaridi hanno prodotto profili diversi: MAL e SUC da un lato e LAC dall’altro. In particolare, il MAL è stato l’unico zucchero che ha modificato il profilo FA rispetto al CEL. Inoltre, il profilo MAL era significativamente diverso dai profili FRU e GLU. In particolare, il profilo MAL ha mostrato la proporzione più alta di C12:0 (54,59 ± 2,17%), rendendolo paragonabile al CEL (43,10 ± 5,01%), LAC (43,35 ± 1,31%), FRU (48,90 ± 1,97%) e Profili GLU (48,38 ± 2,17%) (vedere Tabella Supplementare S1). Lo spettro MAL ha mostrato anche il contenuto più basso di C18:1n9 (9,52 ± 0,50%), che lo differenziava ulteriormente dagli spettri LAC (12,86 ± 0,52%) e CEL (12,40 ± 1,31%). Una tendenza simile è stata osservata per C16:0. Nella seconda componente, lo spettro LAC ha mostrato il contenuto di C18:2n6 più alto (17,22 ± 0,46%), mentre MAL ha mostrato il contenuto più basso (12,58 ± 0,67%). C18:2n6 differenziava anche il LAC dal controllo (CEL), che mostrava livelli più bassi (13,41 ± 2,48%) (vedere Tabella Supplementare S1).
Grafico PCA del profilo degli acidi grassi delle larve di mosca soldato nera con diversi monosaccaridi (fruttosio, galattosio, glucosio), disaccaridi (lattosio, maltosio, saccarosio) e cellulosa come controllo.
Per studiare gli effetti nutrizionali degli zuccheri solubili sulle larve di H. illucens, la cellulosa (CEL) nel mangime per polli è stata sostituita con glucosio (GLU), fruttosio (FRU), galattosio (GAL), maltosio (MAL), saccarosio (SUC) e lattosio (LAC). Tuttavia, monosaccaridi e disaccaridi hanno avuto effetti diversi sullo sviluppo, sulla sopravvivenza e sulla composizione delle larve HF. Ad esempio, GLU, FRU e le loro forme disaccaridiche (MAL e SUC) hanno esercitato effetti di supporto positivi sulla crescita larvale, consentendo loro di raggiungere pesi corporei finali più elevati rispetto a CEL. A differenza dei CEL indigeribili, GLU, FRU e SUC possono oltrepassare la barriera intestinale e fungere da importanti fonti di nutrienti nelle diete formulate16,28. Il MAL è privo di trasportatori animali specifici e si ritiene che venga idrolizzato in due molecole di glucosio prima dell'assimilazione15. Queste molecole vengono immagazzinate nel corpo degli insetti come fonte di energia diretta o come lipidi18. Innanzitutto, per quanto riguarda quest’ultimo, alcune delle differenze intramodali osservate potrebbero essere dovute a piccole differenze nei rapporti tra i sessi. Nell'H. illucens, infatti, la riproduzione può essere del tutto spontanea: le femmine adulte hanno naturalmente sufficienti riserve per la deposizione delle uova e sono più pesanti dei maschi29. Tuttavia, l'accumulo di lipidi nel BSFL è correlato all'assunzione di CH2 solubile nella dieta, come precedentemente osservato per GLU e xilosio26,30. Ad esempio, Li et al.30 hanno osservato che quando alla dieta delle larve veniva aggiunto l'8% di GLU, il contenuto lipidico delle larve di BSF aumentava del 7,78% rispetto ai controlli. I nostri risultati sono coerenti con queste osservazioni, mostrando che il contenuto di grasso nelle larve alimentate con zucchero solubile era superiore a quello delle larve alimentate con la dieta CEL, rispetto a un aumento dell’8,57% con l’integrazione di GLU. Sorprendentemente, risultati simili sono stati osservati nelle larve alimentate con GAL e LAC, nonostante gli effetti avversi sulla crescita delle larve, sul peso corporeo finale e sulla sopravvivenza. Le larve alimentate con LAC erano significativamente più piccole di quelle alimentate con la dieta CEL, ma il loro contenuto di grassi era paragonabile a quello delle larve alimentate con altri zuccheri solubili. Questi risultati evidenziano gli effetti antinutrizionali del lattosio sul BSFL. Innanzitutto, la dieta contiene una grande quantità di CH. I sistemi di assorbimento e idrolisi rispettivamente dei monosaccaridi e dei disaccaridi possono raggiungere la saturazione, causando colli di bottiglia nel processo di assimilazione. Per quanto riguarda l'idrolisi, viene effettuata dalle α- e β-glucosidasi 31 . Questi enzimi hanno substrati preferiti a seconda delle loro dimensioni e dei legami chimici (legami α o β) tra i loro monosaccaridi costituenti 15 . L'idrolisi del LAC in GLU e GAL viene effettuata dalla β-galattosidasi, un enzima la cui attività è stata dimostrata nell'intestino della BSF 32 . Tuttavia, la sua espressione potrebbe essere insufficiente rispetto alla quantità di LAC consumata dalle larve. Al contrario, l’α-glucosidasi maltasi e la saccarasi 15, che sono note per essere abbondantemente espresse negli insetti, sono in grado di scomporre grandi quantità di MAL e saccarosio SUC, limitando così questo effetto saziante. In secondo luogo, gli effetti antinutrizionali potrebbero essere dovuti alla ridotta stimolazione dell’attività dell’amilasi intestinale degli insetti e al rallentamento del comportamento alimentare rispetto ad altri trattamenti. Infatti, gli zuccheri solubili sono stati identificati come stimolatori dell'attività enzimatica importante per la digestione degli insetti, come l'amilasi, e come fattori scatenanti della risposta alimentare33,34,35. Il grado di stimolazione varia a seconda della struttura molecolare dello zucchero. I disaccaridi, infatti, necessitano di idrolisi prima dell'assorbimento e tendono a stimolare l'amilasi più dei monosaccaridi che li costituiscono34. Al contrario, il LAC ha un effetto più lieve e si è rivelato incapace di sostenere la crescita degli insetti in varie specie33,35. Ad esempio, nel parassita Spodoptera exigua (Boddie 1850), non è stata rilevata alcuna attività idrolitica del LAC negli estratti degli enzimi dell'intestino medio del bruco36.
Per quanto riguarda lo spettro FA, i nostri risultati indicano effetti modulatori significativi del CH testato. In particolare, sebbene l’acido laurico (C12:0) rappresentasse meno dell’1% degli acidi grassi totali nella dieta, era dominante in tutti i profili (vedere Tabella Supplementare S1). Ciò è coerente con i dati precedenti secondo cui l'acido laurico viene sintetizzato dal CH alimentare in H. illucens attraverso un percorso che coinvolge l'acetil-CoA carbossilasi e la FA sintasi19,27,37. I nostri risultati confermano che il CEL è in gran parte indigeribile e agisce come un “agente di carica” nelle diete di controllo della BSF, come discusso in diversi studi BSFL38,39,40. La sostituzione del CEL con monosaccaridi e disaccaridi diversi dal LAC ha aumentato il rapporto C12:0, indicando un aumento dell'assorbimento di CH da parte delle larve. È interessante notare che i disaccaridi MAL e SUC promuovono la sintesi dell’acido laurico in modo più efficiente rispetto ai monosaccaridi costituenti, suggerendo che, nonostante il più elevato grado di polimerizzazione di GLU e FRU, e poiché la Drosophila è l’unico trasportatore di saccarosio identificato nelle specie proteiche animali, i trasportatori di disaccaridi potrebbero non essere presenti nell'intestino delle larve di H. illucens15, l'utilizzo di GLU e FRU risulta aumentato. Tuttavia, sebbene GLU e FRU siano teoricamente metabolizzati più facilmente dalla BSF, sono anche più facilmente metabolizzati dai substrati e dai microrganismi intestinali, il che può comportare una loro degradazione più rapida e un ridotto utilizzo da parte delle larve rispetto ai disaccaridi.
A prima vista, il contenuto lipidico delle larve alimentate con LAC e MAL era paragonabile, indicando una biodisponibilità simile di questi zuccheri. Tuttavia, sorprendentemente, il profilo FA del LAC era più ricco di SFA, soprattutto con un contenuto di C12:0 inferiore, rispetto a MAL. Un’ipotesi per spiegare questa differenza è che il LAC possa stimolare il bioaccumulo di acidi grassi alimentari attraverso l’acetil-CoA FA sintasi. A sostegno di questa ipotesi, le larve LAC avevano il rapporto di decanoato (C10:0) più basso (0,77 ± 0,13%) rispetto alla dieta CEL (1,27 ± 0,16%), indicando attività ridotte di FA sintasi e tioesterasi19. In secondo luogo, gli acidi grassi alimentari sono considerati il principale fattore che influenza la composizione degli SFA di H. illucens27. Nei nostri esperimenti, l'acido linoleico (C18:2n6) rappresentava il 54,81% degli acidi grassi alimentari, con una proporzione nelle larve LAC pari a 17,22 ± 0,46% e in MAL 12,58 ± 0,67%. L'acido oleico (cis + trans C18:1n9) (23,22% nella dieta) ha mostrato un andamento simile. Anche il rapporto dell'acido α-linolenico (C18:3n3) supporta l'ipotesi del bioaccumulo. È noto che questo acido grasso si accumula nel BSFL in seguito all'arricchimento del substrato, come l'aggiunta di panelli di semi di lino, fino al 6-9% degli acidi grassi totali nelle larve19. Nelle diete arricchite, il C18:3n3 può rappresentare fino al 35% del totale degli acidi grassi alimentari. Tuttavia, nel nostro studio, C18:3n3 rappresentava solo il 2,51% del profilo degli acidi grassi. Sebbene la proporzione trovata in natura fosse inferiore nelle nostre larve, questa proporzione era maggiore nelle larve LAC (0,87 ± 0,02%) rispetto a quelle MAL (0,49 ± 0,04%) (p <0,001; vedere Tabella Supplementare S1). La dieta CEL aveva una proporzione intermedia di 0,72 ± 0,18%. Infine, il rapporto dell’acido palmitico (C16:0) nelle larve CF riflette il contributo delle vie sintetiche e dell’FA19 alimentare. Hoc et al. 19 hanno osservato che la sintesi di C16:0 veniva ridotta quando la dieta veniva arricchita con farina di semi di lino, il che veniva attribuito ad una diminuzione della disponibilità del substrato di acetil-CoA dovuta ad una diminuzione del rapporto CH. Sorprendentemente, sebbene entrambe le diete avessero un contenuto di CH simile e il MAL mostrasse una biodisponibilità più elevata, le larve di MAL mostravano il rapporto C16:0 più basso (10,46 ± 0,77%), mentre il LAC mostrava una proporzione più elevata, pari a 12,85 ± 0,27% (p < 0,05; vedi Tabella supplementare S1). Questi risultati evidenziano la complessa influenza dei nutrienti sulla digestione e sul metabolismo del BSFL. Attualmente la ricerca su questo argomento è più approfondita sui Lepidotteri che sui Ditteri. Nei bruchi, il LAC è stato identificato come un debole stimolante del comportamento alimentare rispetto ad altri zuccheri solubili come SUC e FRU34,35. In particolare, in Spodopteralittoralis (Boisduval 1833), il consumo di MAL ha stimolato l'attività amilolitica nell'intestino in misura maggiore rispetto a LAC34. Effetti simili nel BSFL possono spiegare la maggiore stimolazione della via sintetica C12:0 nelle larve MAL, che è associata ad un aumento del CH assorbito a livello intestinale, all'alimentazione prolungata e all'azione dell'amilasi intestinale. Una minore stimolazione del ritmo di alimentazione in presenza di LAC può anche spiegare la crescita più lenta delle larve di LAC. Inoltre, Liu Yanxia et al. 27 hanno notato che la durata di conservazione dei lipidi nei substrati di H. illucens era più lunga di quella del CH. Pertanto, le larve LAC possono fare maggiore affidamento sui lipidi alimentari per completare il loro sviluppo, il che può aumentare il loro contenuto lipidico finale e modulare il loro profilo di acidi grassi.
Per quanto ne sappiamo, solo pochi studi hanno testato gli effetti dell’aggiunta di monosaccaridi e disaccaridi alle diete BSF sui loro profili di FA. Innanzitutto, Li et al. 30 hanno valutato gli effetti del GLU e dello xilosio e hanno osservato livelli di lipidi simili ai nostri con un tasso di aggiunta dell'8%. Il profilo degli FA non era dettagliato ed era costituito principalmente da SFA, ma non sono state riscontrate differenze tra i due zuccheri o quando venivano presentati simultaneamente30. Inoltre, Cohn et al. 41 non hanno mostrato alcun effetto dell'aggiunta del 20% di GLU, SUC, FRU e GAL al mangime per polli sui rispettivi profili FA. Questi spettri sono stati ottenuti da repliche tecniche piuttosto che biologiche, il che, come spiegato dagli autori, può limitare l'analisi statistica. Inoltre, la mancanza di controllo degli isozuccheri (utilizzando CEL) limita l'interpretazione dei risultati. Recentemente, due studi di Nugroho RA et al. hanno dimostrato anomalie negli spettri FA42,43. Nel primo studio, Nugroho RA et al. 43 hanno testato l'effetto dell'aggiunta di FRU alla farina di palmisti fermentati. Il profilo FA delle larve risultanti mostrava livelli anormalmente elevati di PUFA, oltre il 90% dei quali derivava dalla dieta contenente il 10% di FRU (simile al nostro studio). Sebbene questa dieta contenesse pellet di pesce ricchi di PUFA, i valori del profilo FA riportati delle larve nella dieta di controllo composta al 100% da PCM fermentato non erano coerenti con alcun profilo riportato in precedenza, in particolare con il livello anormale di C18:3n3 di 17,77. ± 1,67% e 26,08 ± 0,20% per l'acido linoleico coniugato (C18:2n6t), un raro isomero dell'acido linoleico. Il secondo studio ha mostrato risultati simili includendo FRU, GLU, MAL e SUC42 nella farina di palmisti fermentati. Questi studi, come il nostro, evidenziano serie difficoltà nel confrontare i risultati delle prove sulla dieta larvale della BSF, come le scelte di controllo, le interazioni con altre fonti di nutrienti e i metodi di analisi degli FA.
Durante gli esperimenti abbiamo osservato che il colore e l'odore del substrato variavano a seconda della dieta utilizzata. Ciò suggerisce che i microrganismi possono svolgere un ruolo nei risultati osservati nel substrato e nel sistema digestivo delle larve. Infatti, monosaccaridi e disaccaridi vengono facilmente metabolizzati dai microrganismi colonizzatori. Il rapido consumo di zuccheri solubili da parte dei microrganismi può comportare il rilascio di grandi quantità di prodotti metabolici microbici come etanolo, acido lattico, acidi grassi a catena corta (ad esempio acido acetico, acido propionico, acido butirrico) e anidride carbonica44. Alcuni di questi composti potrebbero essere responsabili degli effetti tossici letali sulle larve osservati anche da Cohn et al.41 in condizioni di sviluppo simili. Ad esempio, l’etanolo è dannoso per gli insetti45. Grandi quantità di emissioni di anidride carbonica possono provocare un suo accumulo sul fondo del serbatoio, che può privare l'atmosfera di ossigeno se la circolazione dell'aria non ne consente il rilascio. Per quanto riguarda gli SCFA, i loro effetti sugli insetti, in particolare H. illucens, rimangono poco conosciuti, sebbene sia stato dimostrato che l’acido lattico, l’acido propionico e l’acido butirrico sono letali in Callosobruchus maculatus (Fabricius 1775)46. In Drosophila melanogaster Meigen 1830, questi SCFA sono marcatori olfattivi che guidano le femmine verso i siti di ovideposizione, suggerendo un ruolo benefico nello sviluppo larvale47. Tuttavia, l’acido acetico è classificato come sostanza pericolosa e può inibire significativamente lo sviluppo larvale47. Al contrario, è stato recentemente scoperto che il lattato di derivazione microbica ha un effetto protettivo contro i microbi intestinali invasivi nella Drosophila48. Inoltre, anche i microrganismi presenti nel sistema digestivo svolgono un ruolo nella digestione del CH negli insetti49. Gli effetti fisiologici degli SCFA sul microbiota intestinale, come la velocità di alimentazione e l'espressione genetica, sono stati descritti nei vertebrati 50 . Potrebbero anche avere un effetto trofico sulle larve di H. illucens e contribuire in parte alla regolazione dei profili FA. Gli studi sugli effetti nutrizionali di questi prodotti di fermentazione microbica chiariranno i loro effetti sulla nutrizione dell'H. illucens e forniranno una base per studi futuri su microrganismi benefici o dannosi in termini di sviluppo e valore dei substrati ricchi di FA. A questo proposito, viene sempre più studiato il ruolo dei microrganismi nei processi digestivi degli insetti allevati in massa. Gli insetti stanno cominciando a essere visti come bioreattori, che forniscono condizioni di pH e ossigenazione che facilitano lo sviluppo di microrganismi specializzati nella degradazione o disintossicazione di nutrienti difficili da digerire per gli insetti 51 . Recentemente, Xiang et al.52 hanno dimostrato che, ad esempio, l'inoculazione di rifiuti organici con una miscela batterica consente a CF di attrarre batteri specializzati nella degradazione della lignocellulosa, migliorandone la degradazione nel substrato rispetto ai substrati senza larve.
Infine, per quanto riguarda l'utilizzo benefico dei rifiuti organici da parte di H. illucens, le diete CEL e SUC hanno prodotto il maggior numero di larve al giorno. Ciò significa che, nonostante il peso finale inferiore dei singoli individui, il peso totale delle larve prodotte su un substrato costituito da CH indigeribile è paragonabile a quello ottenuto con una dieta omosaccaridica contenente monosaccaridi e disaccaridi. Nel nostro studio è importante notare che i livelli di altri nutrienti sono sufficienti a supportare la crescita della popolazione larvale e che l'aggiunta di CEL dovrebbe essere limitata. Tuttavia, la composizione finale delle larve differisce, evidenziando l’importanza di scegliere la giusta strategia per valorizzare gli insetti. Le larve CEL alimentate con mangime intero sono più adatte all'uso come mangime per animali a causa del loro minor contenuto di grassi e di livelli inferiori di acido laurico, mentre le larve alimentate con diete SUC o MAL richiedono sgrassatura mediante pressatura per aumentare il valore dell'olio, soprattutto nel biocarburante settore. Il LAC si trova nei sottoprodotti dell'industria lattiero-casearia, come il siero di latte derivante dalla produzione del formaggio. Recentemente, il suo utilizzo (3,5% di lattosio) ha migliorato il peso corporeo finale della larva53. Tuttavia, la dieta di controllo in questo studio conteneva la metà del contenuto lipidico. Pertanto, gli effetti antinutrizionali del LAC potrebbero essere stati contrastati dal bioaccumulo larvale di lipidi alimentari.
Come dimostrato da studi precedenti, le proprietà dei monosaccaridi e dei disaccaridi influenzano significativamente la crescita del BSFL e modulano il suo profilo FA. In particolare, il LAC sembra svolgere un ruolo antinutrizionale durante lo sviluppo larvale limitando la disponibilità di CH per l’assorbimento dei lipidi alimentari, promuovendo così il bioaccumulo di UFA. In questo contesto, sarebbe interessante condurre saggi biologici utilizzando diete che combinano PUFA e LAC. Inoltre, il ruolo dei microrganismi, in particolare il ruolo dei metaboliti microbici (come gli SCFA) derivati dai processi di fermentazione dello zucchero, rimane un argomento di ricerca degno di indagine.
Gli insetti sono stati ottenuti dalla colonia BSF del Laboratorio di Entomologia Funzionale ed Evolutiva fondata nel 2017 presso Agro-Bio Tech, Gembloux, Belgio (per maggiori dettagli sui metodi di allevamento, vedere Hoc et al. 19). Per le prove sperimentali, 2,0 g di uova di BSF sono stati raccolti casualmente ogni giorno da gabbie di allevamento e incubati in 2,0 kg di mangime per polli umido al 70% (Aveve, Leuven, Belgio). Cinque giorni dopo la schiusa, le larve sono state separate dal substrato e contate manualmente a scopo sperimentale. È stato misurato il peso iniziale di ciascun lotto. Il peso individuale medio era di 7,125 ± 0,41 mg e la media per ciascun trattamento è mostrata nella Tabella Supplementare S2.
La formulazione della dieta è stata adattata dallo studio di Barragan-Fonseca et al. 38 . In breve, è stato trovato un compromesso tra la stessa qualità del mangime per i polli allo stadio larvale, un contenuto simile di sostanza secca (SS), un elevato contenuto di CH (10% sulla base della dieta fresca) e una consistenza, poiché gli zuccheri semplici e i disaccaridi non hanno proprietà strutturali. Secondo le informazioni del produttore (Chicken Feed, AVEVE, Leuven, Belgio), il CH testato (ovvero lo zucchero solubile) è stato aggiunto separatamente come soluzione acquosa autoclavata (15,9%) a una dieta composta da 16,0% di proteine, 5,0% di lipidi totali, Mangime macinato per polli composto per l'11,9% da ceneri e per il 4,8% da fibre. In ciascun vaso da 750 ml (17,20 × 11,50 × 6,00 cm, AVA, Tempsee, Belgio), 101,9 g di soluzione CH autoclavata sono stati miscelati con 37,8 g di mangime per polli. Per ciascuna dieta, il contenuto di sostanza secca era del 37,0%, comprese proteine omogenee (11,7%), lipidi omogenei (3,7%) e zuccheri omogenei (26,9% di CH aggiunto). I CH testati erano glucosio (GLU), fruttosio (FRU), galattosio (GAL), maltosio (MAL), saccarosio (SUC) e lattosio (LAC). La dieta di controllo consisteva in cellulosa (CEL), considerata indigeribile per le larve di H. illucens 38 . Cento larve di 5 giorni sono state poste in un vassoio munito di coperchio con un foro centrale di 1 cm di diametro e coperto con una zanzariera di plastica. Ogni dieta è stata ripetuta quattro volte.
Il peso delle larve è stato misurato tre giorni dopo l'inizio dell'esperimento. Per ciascuna misurazione, 20 larve sono state rimosse dal substrato utilizzando acqua calda sterile e una pinza, asciugate e pesate (STX223, Ohaus Scout, Parsippany, USA). Dopo la pesatura, le larve sono state riportate al centro del substrato. Le misurazioni sono state effettuate regolarmente tre volte a settimana fino alla comparsa della prima prepupa. A questo punto raccogliere, contare e pesare tutte le larve come descritto in precedenza. Separare le larve dello stadio 6 (cioè le larve bianche corrispondenti allo stadio larvale che precede lo stadio prepupale) e le prepupe (cioè l'ultimo stadio larvale durante il quale le larve BSF diventano nere, smettono di nutrirsi e cercano un ambiente adatto alla metamorfosi) e conservarle a - 18°C per l'analisi compositiva. La resa è stata calcolata come rapporto tra la massa totale di insetti (larve e prepupe dello stadio 6) ottenuti per piastra (g) e il tempo di sviluppo (d). Tutti i valori medi nel testo sono espressi come: media ± DS.
Tutti i passaggi successivi utilizzando solventi (esano (Hex), cloroformio (CHCl3), metanolo (MeOH)) sono stati eseguiti sotto una cappa aspirante e hanno richiesto l'uso di guanti in nitrile, grembiuli e occhiali di sicurezza.
Le larve bianche sono state essiccate in un liofilizzatore FreeZone6 (Labconco Corp., Kansas City, MO, USA) per 72 ore e poi macinate (IKA A10, Staufen, Germania). I lipidi totali sono stati estratti da ±1 g di polvere utilizzando il metodo Folch 54. Il contenuto di umidità residua di ciascun campione liofilizzato è stato determinato in doppio utilizzando un analizzatore di umidità (MA 150, Sartorius, Göttiggen, Germania) per correggere i lipidi totali.
I lipidi totali sono stati transesterificati in condizioni acide per ottenere esteri metilici di acidi grassi. In breve, circa 10 mg di lipidi/100 µl di soluzione CHCl3 (100 µl) sono stati evaporati con azoto in una provetta Pyrex© da 8 ml (SciLabware – DWK Life Sciences, Londra, Regno Unito). La provetta è stata posta in soluzione esagonale (0,5 ml) (PESTINORM®SUPRATRACE n-esano > 95% per analisi di tracce organiche, VWR Chemicals, Radnor, PA, USA) e soluzione esade/MeOH/BF3 (20/25/55) (0,5 ml) a bagnomaria a 70 °C per 90 min. Dopo il raffreddamento, sono state aggiunte una soluzione acquosa di H2SO4 al 10% (0,2 ml) e una soluzione satura di NaCl (0,5 ml). Mescolare la provetta e riempire la miscela con Hex pulito (8,0 ml). Una porzione della fase superiore è stata trasferita in una fiala e analizzata mediante gascromatografia con un rilevatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID). I campioni sono stati analizzati utilizzando un Trace GC Ultra (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dotato di un iniettore split/splitless (240 °C) in modalità split (flusso suddiviso: 10 mL/min), una colonna Stabilwax®-DA ( 30 m, 0,25 mm d.i., 0,25 μm, Restek Corp., Bellefonte, PA, USA) e un FID (250 °C). Il programma di temperatura è stato impostato come segue: 50 °C per 1 min, aumento a 150 °C a 30 °C/min, aumento a 240 °C a 4 °C/min e continuo a 240 °C per 5 min. Hex è stato utilizzato come bianco e per l'identificazione è stato utilizzato uno standard di riferimento contenente 37 esteri metilici di acidi grassi (Supelco 37-component FAMEmix, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgio). L'identificazione degli acidi grassi insaturi (UFA) è stata confermata mediante GC bidimensionale completa (GC×GC-FID) e la presenza di isomeri è stata determinata accuratamente mediante un leggero adattamento del metodo di Ferrara et al. 55. I dettagli dello strumento possono essere trovati nella Tabella Supplementare S3 e i risultati nella Figura Supplementare S5.
I dati sono presentati in formato foglio di calcolo Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando R Studio (versione 2023.12.1+402, Boston, USA) 56 . I dati sul peso larvale, sul tempo di sviluppo e sulla produttività sono stati stimati utilizzando il modello lineare (LM) (comando "lm", pacchetto R "stats" 56) poiché si adattano a una distribuzione gaussiana. I tassi di sopravvivenza utilizzando l'analisi del modello binomiale sono stati stimati utilizzando il modello lineare generale (GLM) (comando "glm", pacchetto R "lme4" 57). La normalità e l'omoschedasticità sono state confermate utilizzando il test Shapiro (comando "shapiro.test", pacchetto R "stats" 56 ) e l'analisi della varianza dei dati (comando betadisper, pacchetto R "vegan" 58 ). Dopo l'analisi a coppie dei valori p significativi (p <0,05) dal test LM o GLM, sono state rilevate differenze significative tra i gruppi utilizzando il test EMM (comando "emmeans", pacchetto R "emmeans" 59).
Gli spettri FA completi sono stati confrontati utilizzando l'analisi di permutazione multivariata della varianza (ovvero permMANOVA; comando "adonis2", pacchetto R "vegan" 58) utilizzando la matrice della distanza euclidea e 999 permutazioni. Ciò aiuta a identificare gli acidi grassi che sono influenzati dalla natura dei carboidrati alimentari. Differenze significative nei profili FA sono state ulteriormente analizzate utilizzando confronti a coppie. I dati sono stati quindi visualizzati utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) (comando "PCA", pacchetto R "FactoMineR" 60). L'FA responsabile di queste differenze è stato identificato interpretando i cerchi di correlazione. Questi candidati sono stati confermati utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) (comando "aov", pacchetto R "stats" 56 ) seguita dal test post hoc di Tukey (comando TukeyHSD, pacchetto R "stats" 56 ). Prima dell'analisi, la normalità è stata valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk, l'omoschedasticità è stata controllata utilizzando il test di Bartlett (comando "bartlett.test", pacchetto R "stats" 56) ed è stato utilizzato un metodo non parametrico se nessuna delle due ipotesi è stata soddisfatta . Sono state confrontate le analisi (comando “kruskal.test”, pacchetto R “stats” 56 ), quindi sono stati applicati i test post hoc di Dunn (comando dunn.test, pacchetto R “dunn.test” 56 ).
La versione finale del manoscritto è stata controllata utilizzando Grammarly Editor come correttore di bozze inglese (Grammarly Inc., San Francisco, California, USA) 61 .
I set di dati generati e analizzati durante lo studio attuale sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta ragionevole.
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Orario di pubblicazione: 25 dicembre 2024