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A mosca soldado negro (Hermetia illucens, L. 1758) é um inseto detritívoro onívoro com alto potencial para utilização de subprodutos orgânicos ricos em carboidratos. Entre os carboidratos, as moscas soldados negros dependem de açúcares solúveis para crescimento e síntese lipídica. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos dos açúcares solúveis comuns no desenvolvimento, sobrevivência e perfil de ácidos graxos de moscas soldados negros. Suplemente a ração das galinhas com monossacarídeos e dissacarídeos separadamente. A celulose foi usada como controle. As larvas alimentadas com glicose, frutose, sacarose e maltose cresceram mais rapidamente que as larvas controle. Em contrapartida, a lactose teve efeito antinutricional nas larvas, retardando o crescimento e reduzindo o peso corporal final do indivíduo. No entanto, todos os açúcares solúveis tornaram as larvas mais gordas do que aquelas alimentadas com a dieta controle. Notavelmente, os açúcares testados moldaram o perfil de ácidos graxos. A maltose e a sacarose aumentaram o teor de ácidos graxos saturados em comparação à celulose. Em contraste, a lactose aumentou a bioacumulação de ácidos graxos insaturados na dieta. Este estudo é o primeiro a demonstrar o efeito do açúcar solúvel na composição de ácidos graxos das larvas da mosca soldado negro. Nossos resultados indicam que os carboidratos testados têm um efeito significativo na composição de ácidos graxos das larvas da mosca soldado negro e podem, portanto, determinar sua aplicação final.
A procura global de energia e proteína animal continua a aumentar1. No contexto do aquecimento global, é imperativo encontrar alternativas mais ecológicas à energia fóssil e aos métodos tradicionais de produção de alimentos, aumentando simultaneamente a produção. Os insectos são candidatos promissores para resolver estes problemas devido à sua menor composição química e impacto ambiental em comparação com a pecuária tradicional2. Entre os insetos, um excelente candidato para abordar essas questões é a mosca-soldado-negra (BSF), Hermetia illucens (L. 1758), uma espécie detritívora capaz de se alimentar de uma variedade de substratos orgânicos3. Portanto, a valorização desses substratos por meio do melhoramento de BSF poderia criar uma nova fonte de matéria-prima para atender às necessidades de diversas indústrias.
As larvas de BSF (BSFL) podem se alimentar de subprodutos agrícolas e agroindustriais, como grãos de cerveja, resíduos vegetais, polpa de frutas e pão amanhecido, que são particularmente adequados para o crescimento de BSFL devido ao seu alto teor de carboidratos (CH)4,5, 6 conteúdo. A produção em larga escala de BSFL resulta na formação de dois produtos: as fezes, uma mistura de resíduos de substrato e fezes que podem ser utilizadas como fertilizante para o cultivo de plantas7, e as larvas, que são compostas principalmente por proteínas, lipídios e quitina. Proteínas e lipídios são utilizados principalmente na pecuária, biocombustíveis e cosméticos8,9. Quanto à quitina, este biopolímero encontra aplicações no setor agroalimentar, na biotecnologia e na saúde10.
O BSF é um inseto holometábolo autógeno, o que significa que sua metamorfose e reprodução, principalmente as fases do ciclo de vida do inseto que consomem energia, podem ser inteiramente sustentadas pelas reservas de nutrientes geradas durante o crescimento larval . Mais especificamente, a síntese de proteínas e lipídios leva ao desenvolvimento do corpo gorduroso, um importante órgão de armazenamento que libera energia durante as fases de não alimentação da FMB: pré-pupa (ou seja, o estágio larval final durante o qual as larvas da FMB ficam pretas enquanto se alimentam e procuram para um ambiente adequado para metamorfose), pupas (ou seja, o estágio imóvel durante o qual o inseto sofre metamorfose) e adultos12,13. O CH é a principal fonte de energia na dieta da FMB14. Dentre esses nutrientes, o CH fibroso como a hemicelulose, a celulose e a lignina, diferentemente dos dissacarídeos e polissacarídeos (como o amido), não podem ser digeridos pelo BSFL15,16. A digestão do CH é uma etapa preliminar importante para a absorção de carboidratos, que são finalmente hidrolisados em açúcares simples no intestino16. Os açúcares simples podem então ser absorvidos (ou seja, através da membrana peritrófica intestinal) e metabolizados para produzir energia17. Como mencionado acima, as larvas armazenam o excesso de energia na forma de lipídios no corpo gorduroso12,18. Os lipídios de armazenamento consistem em triglicerídeos (lipídios neutros formados a partir de uma molécula de glicerol e três ácidos graxos) sintetizados pelas larvas a partir de açúcares simples da dieta. Esses CH fornecem os substratos de acetil-CoA necessários para a biossíntese de ácidos graxos (FA) através das vias sintase e tioesterase de ácidos graxos . O perfil de ácidos graxos dos lipídios de H. illucens é naturalmente dominado por ácidos graxos saturados (SFA) com alta proporção de ácido láurico (C12:0) . Portanto, o alto teor lipídico e a composição de ácidos graxos estão rapidamente se tornando fatores limitantes para o uso de larvas inteiras na alimentação animal, especialmente na aquicultura, onde são necessários ácidos graxos poliinsaturados (PUFA)21.
Desde a descoberta do potencial do BSFL para reduzir resíduos orgânicos, estudos sobre o valor de vários subprodutos mostraram que a composição do BSFL é parcialmente regulada pela sua dieta. Atualmente, a regulamentação do perfil de FA de H. illucens continua a melhorar. A capacidade do BSFL de bioacumular PUFA foi demonstrada em substratos ricos em PUFA, como algas, resíduos de peixe ou farinhas como semente de linhaça, o que fornece um perfil de AG de maior qualidade para nutrição animal19,22,23. Por outro lado, para subprodutos que não são enriquecidos em PUFA, nem sempre há uma correlação entre os perfis de AG da dieta e o AG larval, indicando a influência de outros nutrientes24,25. Na verdade, o efeito do CH digestível nos perfis de AG permanece pouco compreendido e pouco pesquisado24,25,26,27.
Até onde sabemos, embora os monossacarídeos e dissacarídeos totais sejam abundantes na dieta de H. illucens, seu papel nutricional permanece pouco compreendido na nutrição de H. illucens. O objetivo deste estudo foi elucidar seus efeitos na nutrição e na composição lipídica do BSFL. Avaliaremos o crescimento, sobrevivência e produtividade de larvas sob diferentes condições nutricionais. Em seguida, descreveremos o conteúdo lipídico e o perfil de ácidos graxos de cada dieta para destacar os efeitos do CH na qualidade nutricional do BSFL.
Nossa hipótese é que a natureza do CH testado afetaria (1) o crescimento larval, (2) os níveis lipídicos totais e (3) modularia o perfil de FA. Os monossacarídeos podem ser absorvidos diretamente, enquanto os dissacarídeos devem ser hidrolisados. Os monossacarídeos estão, portanto, mais disponíveis como fontes diretas de energia ou precursores para a lipogênese através das vias FA sintase e tioesterase, aumentando assim o crescimento larval de H. illucens e promovendo o acúmulo de lipídios de reserva (especialmente ácido láurico).
O CH testado afetou o peso corporal médio das larvas durante o crescimento (Fig. 1). FRU, GLU, SUC e MAL aumentaram o peso corporal das larvas de forma semelhante à dieta controle (CEL). Em contraste, LAC e GAL pareceram retardar o desenvolvimento larval. Notavelmente, o LAC teve um efeito negativo significativo no crescimento larval em comparação com o SUC durante todo o período de crescimento: 9,16 ± 1,10 mg versus 15,00 ± 1,01 mg no dia 3 (F6,21 = 12,77, p < 0,001; Fig. 1), 125,11 ± 4,26 mg e 211,79 ± 14,93 mg, respectivamente, no dia 17 (F6,21 = 38,57, p < 0,001; Figura 1).
Utilizando diferentes monossacarídeos (frutose (FRU), galactose (GAL), glicose (GLU)), dissacarídeos (lactose (LAC), maltose (MAL), sacarose (SUC)) e celulose (CEL) como controles. Crescimento de larvas alimentadas com larvas de mosca soldado negro. Cada ponto da curva representa o peso médio individual (mg) calculado pela pesagem de 20 larvas selecionadas aleatoriamente de uma população de 100 larvas (n = 4). Barras de erro representam SD.
A dieta CEL proporcionou excelente sobrevivência larval de 95,5 ± 3,8%. Além disso, a sobrevivência de H. illucens alimentados com dietas contendo CH solúvel foi reduzida (GLM: χ = 107,13, df = 21, p <0,001), o que foi causado por MAL e SUC (dissacarídeos) no CH estudado. A mortalidade foi inferior à de GLU, FRU, GAL (monossacarídeo) e LAC (EMM: p < 0,001, Figura 2).
Boxplot de sobrevivência de larvas de mosca soldado negra tratadas com vários monossacarídeos (frutose, galactose, glicose), dissacarídeos (lactose, maltose, sacarose) e celulose como controles. Os tratamentos com a mesma letra não diferem significativamente entre si (EMM, p > 0,05).
Todas as dietas testadas permitiram que as larvas atingissem o estágio pré-pupal. Entretanto, os CHs testados tenderam a prolongar o desenvolvimento larval (F6,21=9,60, p<0,001; Tabela 1). Em particular, as larvas alimentadas com GAL e LAC demoraram mais para atingir o estágio pré-pupal em comparação com as larvas criadas em CEL (CEL-GAL: p<0,001; CEL-LAC: p<0,001; Tabela 1).
O CH testado também teve efeitos diferentes no peso corporal das larvas, com o peso corporal das larvas alimentadas com a dieta CEL atingindo 180,19 ± 11,35 mg (F6,21 = 16,86, p < 0,001; Figura 3). FRU, GLU, MAL e SUC resultaram em um peso corporal larval final médio superior a 200 mg, que foi significativamente maior que o do CEL (p <0,05). Em contrapartida, as larvas alimentadas com GAL e LAC apresentaram pesos corporais mais baixos, com média de 177,64 ± 4,23 mg e 156,30 ± 2,59 mg, respectivamente (p < 0,05). Este efeito foi mais pronunciado com LAC, onde o peso corporal final foi menor do que com a dieta controle (CEL-LAC: diferença = 23,89 mg; p = 0,03; Figura 3).
Peso final médio de larvas individuais expresso como manchas larvais (mg) e moscas-soldado preto expresso como histograma (g) alimentados com diferentes monossacarídeos (frutose, galactose, glicose), dissacarídeos (lactose, maltose, sacarose) e celulose (como controle). Letras colunares representam grupos significativamente diferentes no peso larval total (p <0,001). Letras associadas a manchas larvais representam grupos com pesos larvais individuais significativamente diferentes (p < 0,001). Barras de erro representam SD.
O peso máximo individual foi independente do peso final máximo da colônia larval total. Na verdade, as dietas contendo FRU, GLU, MAL e SUC não aumentaram o peso total das larvas produzidas no tanque em comparação com o CEL (Figura 3). Entretanto, o LAC diminuiu significativamente o peso total (CEL-LAC: diferença = 9,14 g; p < 0,001; Figura 3).
A Tabela 1 mostra o rendimento (larvas/dia). Curiosamente, os rendimentos ótimos de CEL, MAL e SUC foram semelhantes (Tabela 1). Em contrapartida, FRU, GAL, GLU e LAC reduziram o rendimento em comparação ao CEL (Tabela 1). GAL e LAC tiveram o pior desempenho: o rendimento foi reduzido pela metade para apenas 0,51 ± 0,09 g larvas/dia e 0,48 ± 0,06 g larvas/dia, respectivamente (Tabela 1).
Monossacarídeos e dissacarídeos aumentaram o conteúdo lipídico das larvas de FC (Tabela 1). Na dieta CLE foram obtidas larvas com teor lipídico de 23,19 ± 0,70% do teor de MS. Para efeito de comparação, o teor médio de lipídios em larvas alimentadas com açúcar solúvel foi superior a 30% (Tabela 1). No entanto, os CHs testados aumentaram o seu teor de gordura na mesma medida.
Como esperado, os indivíduos do GC afetaram o perfil de AF das larvas em graus variados (Fig. 4). O teor de SFA foi elevado em todas as dietas e atingiu mais de 60%. MAL e SUC desequilibraram o perfil de AF, o que levou a um aumento no teor de SFA. No caso do MAL, por um lado, esse desequilíbrio levou predominantemente à diminuição do teor de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) (F6,21 = 7,47; p < 0,001; Fig. 4). Por outro lado, para o SUC, a diminuição foi mais uniforme entre MUFA e PUFA. LAC e MAL tiveram efeitos opostos no espectro FA (SFA: F6,21 = 8,74; p < 0,001; MUFA: F6,21 = 7,47; p < 0,001; PUFA: χ2 = 19,60; Df = 6; p < 0,001; Figura 4). A menor proporção de SFA em larvas alimentadas com ALC parece aumentar o teor de MUFA. Em particular, os níveis de MUFA foram mais elevados nas larvas alimentadas com LAC em comparação com outros açúcares solúveis, exceto GAL (F6,21 = 7,47; p < 0,001; Figura 4).
Usando diferentes monossacarídeos (frutose (FRU), galactose (GAL), glicose (GLU)), dissacarídeos (lactose (LAC), maltose (MAL), sacarose (SUC)) e celulose (CEL) como controles, box plot de ácidos graxos composição alimentada com larvas de mosca soldado negro. Os resultados são expressos como percentagem do FAME total. Os tratamentos marcados com letras diferentes são significativamente diferentes (p < 0,001). (a) Proporção de ácidos graxos saturados; (b) Ácidos graxos monoinsaturados; (c) Ácidos graxos poliinsaturados.
Entre os ácidos graxos identificados, o ácido láurico (C12:0) foi dominante em todos os espectros observados (mais de 40%). Outros SFAs presentes foram ácido palmítico (C16:0) (menos de 10%), ácido esteárico (C18:0) (menos de 2,5%) e ácido cáprico (C10:0) (menos de 1,5%). Os MUFAs foram representados principalmente pelo ácido oleico (C18: 1n9) (menos de 9, 5%), enquanto os PUFAs foram compostos principalmente por ácido linoléico (C18: 2n6) (menos de 13, 0%) (ver Tabela Suplementar S1). Além disso, uma pequena proporção de compostos não pôde ser identificada, especialmente nos espectros de larvas CEL, onde o composto não identificado número 9 (UND9) representou uma média de 2, 46 ± 0, 52% (ver Tabela Suplementar S1). A análise GC×GC-FID sugeriu que poderia ser um ácido graxo de 20 carbonos com cinco ou seis ligações duplas (ver Figura Suplementar S5).
A análise PERMANOVA revelou três grupos distintos com base nos perfis de ácidos graxos (F6,21 = 7,79, p < 0,001; Figura 5). A análise de componentes principais (PCA) do espectro TBC ilustra isso e é explicada por dois componentes (Figura 5). Os componentes principais explicaram 57,9% da variância e incluíram, em ordem de importância, ácido láurico (C12:0), ácido oleico (C18:1n9), ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0) e ácido linolênico (C18:3n3) (ver Figura S4). O segundo componente explicou 26,3% da variância e incluiu, em ordem de importância, ácido decanóico (C10: 0) e ácido linoléico (C18: 2n6 cis) (ver Figura Suplementar S4). Os perfis das dietas contendo açúcares simples (FRU, GAL e GLU) apresentaram características semelhantes. Em contraste, os dissacarídeos produziram perfis diferentes: MAL e SUC por um lado e LAC por outro. Em particular, o MAL foi o único açúcar que alterou o perfil de AF em comparação com o CEL. Além disso, o perfil MAL foi significativamente diferente dos perfis FRU e GLU. Em particular, o perfil MAL apresentou a maior proporção de C12:0 (54,59 ± 2,17%), tornando-o comparável ao CEL (43,10 ± 5,01%), LAC (43,35 ± 1,31%), FRU (48,90 ± 1,97%) e Perfis GLU (48,38 ± 2,17%) (ver Tabela Suplementar S1). O espectro MAL também apresentou o menor teor de C18:1n9 (9,52 ± 0,50%), o que o diferenciou ainda mais dos espectros LAC (12,86 ± 0,52%) e CEL (12,40 ± 1,31%). Uma tendência semelhante foi observada para C16:0. No segundo componente, o espectro LAC apresentou o maior teor de C18:2n6 (17,22 ± 0,46%), enquanto o MAL apresentou o menor (12,58 ± 0,67%). C18:2n6 também diferenciou o LAC do controle (CEL), que apresentou níveis mais baixos (13,41 ± 2,48%) (ver Tabela Suplementar S1).
Gráfico PCA do perfil de ácidos graxos de larvas de mosca soldado negro com diferentes monossacarídeos (frutose, galactose, glicose), dissacarídeos (lactose, maltose, sacarose) e celulose como controle.
Para estudar os efeitos nutricionais dos açúcares solúveis nas larvas de H. illucens, a celulose (CEL) na ração das galinhas foi substituída por glicose (GLU), frutose (FRU), galactose (GAL), maltose (MAL), sacarose (SUC) e lactose (LAC). No entanto, monossacarídeos e dissacarídeos tiveram efeitos diferentes no desenvolvimento, sobrevivência e composição das larvas de HF. Por exemplo, GLU, FRU e suas formas dissacarídicas (MAL e SUC) exerceram efeitos positivos de suporte no crescimento larval, permitindo-lhes atingir pesos corporais finais mais elevados do que CEL. Ao contrário do CEL indigerível, GLU, FRU e SUC podem contornar a barreira intestinal e servir como importantes fontes de nutrientes em dietas formuladas16,28. O MAL carece de transportadores animais específicos e acredita-se que seja hidrolisado em duas moléculas de glicose antes da assimilação . Essas moléculas são armazenadas no corpo do inseto como fonte direta de energia ou como lipídios18. Primeiro, no que diz respeito a este último, algumas das diferenças intramodais observadas podem ser devidas a pequenas diferenças nas proporções sexuais. Na verdade, em H. illucens, a reprodução pode ser totalmente espontânea: as fêmeas adultas têm naturalmente reservas de postura suficientes e são mais pesadas que os machos29. No entanto, o acúmulo de lipídios no BSFL correlaciona-se com a ingestão de CH2 solúvel na dieta, como observado anteriormente para GLU e xilose26,30. Por exemplo, Li et al.30 observaram que quando 8% de GLU foi adicionado à dieta larval, o conteúdo lipídico das larvas de BSF aumentou 7,78% em comparação aos controles. Nossos resultados são consistentes com essas observações, mostrando que o teor de gordura nas larvas alimentadas com açúcar solúvel foi maior do que nas larvas alimentadas com a dieta CEL, em comparação com um aumento de 8,57% com a suplementação de GLU. Surpreendentemente, resultados semelhantes foram observados em larvas alimentadas com GAL e LAC, apesar dos efeitos adversos no crescimento larval, no peso corporal final e na sobrevivência. As larvas alimentadas com LAC eram significativamente menores do que aquelas alimentadas com a dieta CEL, mas seu teor de gordura era comparável ao das larvas alimentadas com outros açúcares solúveis. Estes resultados destacam os efeitos antinutricionais da lactose na BSFL. Primeiro, a dieta contém uma grande quantidade de CH. Os sistemas de absorção e hidrólise de monossacarídeos e dissacarídeos, respectivamente, podem atingir a saturação, causando gargalos no processo de assimilação. Já a hidrólise é realizada pelas α- e β-glicosidases 31 . Estas enzimas possuem substratos preferidos dependendo do seu tamanho e das ligações químicas (ligações α ou β) entre os seus monossacarídeos constituintes 15 . A hidrólise de LAC em GLU e GAL é realizada pela β-galactosidase, uma enzima cuja atividade foi demonstrada no intestino de BSF 32 . No entanto, a sua expressão pode ser insuficiente em comparação com a quantidade de LAC consumida pelas larvas. Em contraste, a α-glucosidase maltase e a sacarase 15, que são conhecidas por serem abundantemente expressas em insetos, são capazes de quebrar grandes quantidades de MAL e sacarose SUC, limitando assim este efeito saciante. Em segundo lugar, os efeitos antinutricionais podem ser devidos à estimulação reduzida da actividade da amilase intestinal dos insectos e ao abrandamento do comportamento alimentar em comparação com outros tratamentos. Na verdade, os açúcares solúveis foram identificados como estimuladores da atividade enzimática importante para a digestão dos insetos, como a amilase, e como desencadeadores da resposta alimentar33,34,35. O grau de estimulação varia dependendo da estrutura molecular do açúcar. Na verdade, os dissacarídeos requerem hidrólise antes da absorção e tendem a estimular mais a amilase do que os seus monossacarídeos constituintes34. Em contraste, a ALC tem um efeito mais suave e foi considerada incapaz de apoiar o crescimento de insetos em várias espécies33,35. Por exemplo, na praga Spodoptera exigua (Boddie 1850), nenhuma atividade hidrolítica da LAC foi detectada em extratos de enzimas do intestino médio da lagarta .
Em relação ao espectro FA, nossos resultados indicam efeitos modulatórios significativos do CH testado. Notavelmente, embora o ácido láurico (C12: 0) representasse menos de 1% do total de AG na dieta, dominou em todos os perfis (ver Tabela Suplementar S1). Isto é consistente com dados anteriores de que o ácido láurico é sintetizado a partir de CH dietético em H. illucens através de uma via envolvendo acetil-CoA carboxilase e FA sintase . Nossos resultados confirmam que o CEL é amplamente indigerível e atua como um “agente de volume” nas dietas de controle da FMB, conforme discutido em vários estudos da BSFL38,39,40. A substituição do CEL por monossacarídeos e dissacarídeos diferentes do LAC aumentou a proporção C12: 0, indicando aumento da captação de CH pelas larvas. Curiosamente, os dissacarídeos MAL e SUC promovem a síntese de ácido láurico de forma mais eficiente do que os seus monossacarídeos constituintes, sugerindo que, apesar do maior grau de polimerização de GLU e FRU, e uma vez que Drosophila é o único transportador de sacarose identificado em espécies de proteínas animais, os transportadores de dissacarídeos pode não estar presente no intestino das larvas de H. illucens15, a utilização de GLU e FRU aumenta. No entanto, embora GLU e FRU sejam teoricamente mais facilmente metabolizados pela BSF, eles também são mais facilmente metabolizados por substratos e microrganismos intestinais, o que pode resultar na sua degradação mais rápida e na diminuição da utilização pelas larvas em comparação com os dissacarídeos.
À primeira vista, o conteúdo lipídico das larvas alimentadas com LAC e MAL foi comparável, indicando biodisponibilidade semelhante destes açúcares. Contudo, surpreendentemente, o perfil de AF da LAC foi mais rico em SFA, especialmente com menor teor de C12:0, em comparação com MAL. Uma hipótese para explicar essa diferença é que a ALC pode estimular a bioacumulação de AG na dieta via acetil-CoA FA sintase. Apoiando esta hipótese, as larvas LAC tiveram a menor proporção de decanoato (C10: 0) (0,77 ± 0,13%) do que a dieta CEL (1,27 ± 0,16%), indicando atividades reduzidas de FA sintase e tioesterase . Em segundo lugar, os ácidos graxos dietéticos são considerados o principal fator que influencia a composição de SFA de H. illucens27. Em nossos experimentos, o ácido linoléico (C18:2n6) representou 54,81% dos ácidos graxos da dieta, sendo a proporção nas larvas LAC de 17,22 ± 0,46% e no MAL de 12,58 ± 0,67%. O ácido oleico (cis + trans C18:1n9) (23,22% na dieta) apresentou tendência semelhante. A proporção de ácido α-linolênico (C18:3n3) também apoia a hipótese de bioacumulação. Sabe-se que esse ácido graxo se acumula no BSFL após o enriquecimento do substrato, como a adição de torta de linhaça, até 6-9% do total de ácidos graxos nas larvas . Em dietas enriquecidas, o C18:3n3 pode representar até 35% do total de ácidos graxos da dieta. Porém, em nosso estudo, C18:3n3 representou apenas 2,51% do perfil de ácidos graxos. Embora a proporção encontrada na natureza tenha sido menor em nossas larvas, essa proporção foi maior em larvas LAC (0,87 ± 0,02%) do que em MAL (0,49 ± 0,04%) (p <0,001; ver Tabela Suplementar S1). A dieta CEL apresentou proporção intermediária de 0,72 ± 0,18%. Finalmente, a proporção de ácido palmítico (C16:0) em larvas de FC reflete a contribuição das vias sintéticas e da FA na dieta19. Hoc et al. 19 observaram que a síntese de C16:0 foi reduzida quando a dieta foi enriquecida com farinha de linhaça, o que foi atribuído à diminuição da disponibilidade do substrato acetil-CoA devido à diminuição da proporção de CH. Surpreendentemente, embora ambas as dietas tivessem conteúdo semelhante de CH e o MAL apresentasse maior biodisponibilidade, as larvas do MAL apresentaram a menor proporção C16:0 (10,46 ± 0,77%), enquanto o LAC apresentou uma proporção maior, representando 12,85 ± 0,27% (p < 0,05; ver Tabela Suplementar S1). Estes resultados destacam a complexa influência dos nutrientes na digestão e no metabolismo do BSFL. Atualmente, as pesquisas sobre esse tema são mais aprofundadas em Lepidoptera do que em Diptera. Nas lagartas, o LAC foi identificado como um fraco estimulante do comportamento alimentar em comparação com outros açúcares solúveis como SUC e FRU34,35. Em particular, em Spodopteralittoralis (Boisduval 1833), o consumo de MAL estimulou a atividade amilolítica no intestino em maior extensão do que o LAC34. Efeitos semelhantes no BSFL podem explicar a estimulação aumentada da via sintética C12: 0 nas larvas MAL, que está associada ao aumento do CH absorvido intestinalmente, à alimentação prolongada e à ação da amilase intestinal. A menor estimulação do ritmo alimentar na presença de LAC também pode explicar o crescimento mais lento das larvas de LAC. Além disso, Liu Yanxia et al. 27 observaram que a vida útil dos lipídios em substratos de H. illucens foi maior que a do CH. Portanto, as larvas da ALC podem depender mais de lipídios dietéticos para completar seu desenvolvimento, o que pode aumentar seu conteúdo lipídico final e modular seu perfil de ácidos graxos.
Até onde sabemos, apenas alguns estudos testaram os efeitos da adição de monossacarídeos e dissacarídeos às dietas BSF em seus perfis de AG. Primeiro, Li et al. 30 avaliaram os efeitos do GLU e da xilose e observaram níveis lipídicos semelhantes aos nossos com uma taxa de adição de 8%. O perfil de AG não foi detalhado e consistia principalmente de SFA, mas não foram encontradas diferenças entre os dois açúcares ou quando foram apresentados simultaneamente30. Além disso, Cohn et al. 41 não mostraram nenhum efeito da adição de 20% de GLU, SUC, FRU e GAL à ração de frango nos respectivos perfis de FA. Esses espectros foram obtidos a partir de réplicas técnicas e não biológicas, o que, conforme explicado pelos autores, pode limitar a análise estatística. Além disso, a falta de controle iso-açúcar (usando CEL) limita a interpretação dos resultados. Recentemente, dois estudos de Nugroho RA et al. demonstraram anomalias nos espectros de FA . No primeiro estudo, Nugroho RA et al. 43 testaram o efeito da adição de FRU à farinha fermentada de palmiste. O perfil de FA das larvas resultantes mostrou níveis anormalmente elevados de PUFA, mais de 90% dos quais foram derivados da dieta contendo 10% de FRU (semelhante ao nosso estudo). Embora esta dieta contivesse pellets de peixe ricos em PUFA, os valores relatados do perfil de FA das larvas na dieta controle consistindo de PCM 100% fermentado não foram consistentes com qualquer perfil relatado anteriormente, em particular o nível anormal de C18:3n3 de 17,77. ± 1,67% e 26,08 ± 0,20% para ácido linoléico conjugado (C18:2n6t), um isômero raro de ácido linoléico. O segundo estudo mostrou resultados semelhantes incluindo FRU, GLU, MAL e SUC42 em farinha de palmiste fermentada. Esses estudos, como o nosso, destacam sérias dificuldades na comparação dos resultados dos ensaios de dieta larval de BSF, como escolhas de controle, interações com outras fontes de nutrientes e métodos de análise de AF.
Durante os experimentos, observamos que a cor e o odor do substrato variaram dependendo da dieta utilizada. Isto sugere que os microrganismos podem desempenhar um papel nos resultados observados no substrato e no sistema digestivo das larvas. Na verdade, monossacarídeos e dissacarídeos são facilmente metabolizados pelos microrganismos colonizadores. O rápido consumo de açúcares solúveis pelos microrganismos pode resultar na libertação de grandes quantidades de produtos metabólicos microbianos, tais como etanol, ácido láctico, ácidos gordos de cadeia curta (por exemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico) e dióxido de carbono44. Alguns destes compostos podem ser responsáveis pelos efeitos tóxicos letais nas larvas também observados por Cohn et al.41 sob condições de desenvolvimento semelhantes. Por exemplo, o etanol é prejudicial aos insetos45. Grandes quantidades de emissões de dióxido de carbono podem resultar na sua acumulação no fundo do tanque, o que pode privar a atmosfera de oxigénio se a circulação do ar não permitir a sua libertação. Em relação aos SCFAs, seus efeitos sobre insetos, especialmente H. illucens, permanecem pouco compreendidos, embora o ácido láctico, o ácido propiônico e o ácido butírico tenham demonstrado ser letais em Callosobruchus maculatus (Fabricius 1775)46. Em Drosophila melanogaster Meigen 1830, esses SCFAs são marcadores olfativos que orientam as fêmeas até os locais de oviposição, sugerindo um papel benéfico no desenvolvimento larval . Contudo, o ácido acético é classificado como uma substância perigosa e pode inibir significativamente o desenvolvimento larval47. Em contraste, descobriu-se recentemente que o lactato derivado microbianamente tem um efeito protetor contra micróbios intestinais invasivos em Drosophila48. Além disso, os microrganismos do sistema digestivo também desempenham um papel na digestão do CH em insetos . Os efeitos fisiológicos dos AGCC na microbiota intestinal, tais como a taxa de alimentação e a expressão genética, foram descritos em vertebrados 50 . Eles também podem ter um efeito trófico nas larvas de H. illucens e podem contribuir em parte para a regulação dos perfis de AF. Estudos sobre os efeitos nutricionais destes produtos de fermentação microbiana irão esclarecer os seus efeitos na nutrição de H. illucens e fornecer uma base para estudos futuros sobre microrganismos benéficos ou prejudiciais em termos do seu desenvolvimento e do valor de substratos ricos em ácidos gordos. A este respeito, o papel dos microrganismos nos processos digestivos dos insetos cultivados em massa está sendo cada vez mais estudado. Os insetos estão começando a ser vistos como biorreatores, proporcionando condições de pH e oxigenação que facilitam o desenvolvimento de microrganismos especializados na degradação ou desintoxicação de nutrientes de difícil digestão para os insetos 51 . Recentemente, Xiang et al.52 demonstraram que, por exemplo, a inoculação de resíduos orgânicos com uma mistura bacteriana permite que o FC atraia bactérias especializadas na degradação da lignocelulose, melhorando a sua degradação no substrato em comparação com substratos sem larvas.
Por fim, no que diz respeito ao aproveitamento benéfico dos resíduos orgânicos por H. illucens, as dietas CEL e SUC produziram o maior número de larvas por dia. Isto significa que, apesar do menor peso final dos indivíduos, o peso total das larvas produzido num substrato constituído por CH indigestível é comparável ao obtido numa dieta homossacarídica contendo monossacarídeos e dissacarídeos. No nosso estudo, é importante notar que os níveis de outros nutrientes são suficientes para suportar o crescimento da população larval e que a adição de CEL deve ser limitada. Porém, a composição final das larvas difere, destacando a importância da escolha da estratégia correta para valorização dos insetos. As larvas CEL alimentadas com ração integral são mais adequadas para uso como ração animal devido ao seu menor teor de gordura e menores níveis de ácido láurico, enquanto as larvas alimentadas com dietas SUC ou MAL requerem desengorduramento por prensagem para aumentar o valor do óleo, especialmente no biocombustível setor. A ALC é encontrada em subprodutos da indústria de laticínios, como o soro de leite da produção de queijo. Recentemente, seu uso (3,5% de lactose) melhorou o peso corporal final das larvas53. No entanto, a dieta controle neste estudo continha metade do conteúdo lipídico. Portanto, os efeitos antinutricionais da LAC podem ter sido neutralizados pela bioacumulação larval de lipídios na dieta.
Conforme demonstrado por estudos anteriores, as propriedades dos monossacarídeos e dissacarídeos afetam significativamente o crescimento do BSFL e modulam o seu perfil de AG. Em particular, a ALC parece desempenhar um papel antinutricional durante o desenvolvimento larval, limitando a disponibilidade de CH para a absorção lipídica na dieta, promovendo assim a bioacumulação de UFA. Neste contexto, seria interessante realizar bioensaios utilizando dietas combinando PUFA e LAC. Além disso, o papel dos microrganismos, especialmente o papel dos metabolitos microbianos (como os SCFAs) derivados dos processos de fermentação do açúcar, continua a ser um tema de investigação digno de investigação.
Os insetos foram obtidos na colônia BSF do Laboratório de Entomologia Funcional e Evolutiva estabelecido em 2017 na Agro-Bio Tech, Gembloux, Bélgica (para mais detalhes sobre métodos de criação, ver Hoc et al. 19). Para ensaios experimentais, 2,0 g de ovos de BSF foram coletados aleatoriamente diariamente em gaiolas de reprodução e incubados em 2,0 kg de ração úmida de galinha a 70% (Aveve, Leuven, Bélgica). Cinco dias após a eclosão, as larvas foram separadas do substrato e contadas manualmente para fins experimentais. O peso inicial de cada lote foi medido. O peso médio individual foi de 7,125 ± 0,41 mg, e a média de cada tratamento é apresentada na Tabela Suplementar S2.
A formulação da dieta foi adaptada do estudo de Barragan-Fonseca et al. 38. Resumidamente, foi encontrado um compromisso entre a mesma qualidade alimentar para larvas de galinhas, teor semelhante de matéria seca (MS), alto CH (10% com base na dieta fresca) e textura, uma vez que açúcares simples e dissacarídeos não possuem propriedades texturais. De acordo com informações do fabricante (Chicken Feed, AVEVE, Leuven, Bélgica), o CH testado (ou seja, açúcar solúvel) foi adicionado separadamente como uma solução aquosa autoclavada (15,9%) a uma dieta composta por 16,0% de proteína, 5,0% de lipídios totais, 11,9% de ração moída para frango composta por cinzas e 4,8% de fibra. Em cada frasco de 750 ml (17,20 × 11,50 × 6,00 cm, AVA, Tempsee, Bélgica), 101,9 g de solução CH autoclavada foram misturados com 37,8 g de ração para galinhas. Para cada dieta, o teor de matéria seca foi de 37,0%, incluindo proteína homogênea (11,7%), lipídios homogêneos (3,7%) e açúcares homogêneos (26,9% de CH adicionado). Os CH testados foram glicose (GLU), frutose (FRU), galactose (GAL), maltose (MAL), sacarose (SUC) e lactose (LAC). A dieta controle consistiu de celulose (CEL), considerada indigestível para larvas de H. illucens 38 . Cem larvas com 5 dias de idade foram colocadas em uma bandeja com tampa com furo de 1 cm de diâmetro no meio e coberta com mosquiteiro plástico. Cada dieta foi repetida quatro vezes.
Os pesos das larvas foram medidos três dias após o início do experimento. Para cada medição, 20 larvas foram removidas do substrato utilizando água morna estéril e pinça, secas e pesadas (STX223, Ohaus Scout, Parsippany, EUA). Após a pesagem, as larvas foram devolvidas ao centro do substrato. As medições foram feitas regularmente três vezes por semana até o surgimento da primeira pré-pupa. Neste ponto, colete, conte e pese todas as larvas conforme descrito anteriormente. Separe as larvas do estágio 6 (ou seja, larvas brancas correspondentes ao estágio larval anterior ao estágio pré-pupal) e pré-pupas (ou seja, o último estágio larval durante o qual as larvas BSF ficam pretas, param de se alimentar e procuram um ambiente adequado para a metamorfose) e armazenam em - 18°C para análise de composição. O rendimento foi calculado como a razão entre a massa total de insetos (larvas e pré-pupas do estágio 6) obtida por placa (g) e o tempo de desenvolvimento (d). Todos os valores médios no texto são expressos como: média ± DP.
Todas as etapas subsequentes utilizando solventes (hexano (Hex), clorofórmio (CHCl3), metanol (MeOH)) foram realizadas sob uma capela e exigiram o uso de luvas de nitrila, aventais e óculos de segurança.
As larvas brancas foram secas em um liofilizador FreeZone6 (Labconco Corp., Kansas City, MO, EUA) por 72 horas e depois moídas (IKA A10, Staufen, Alemanha). Os lipídios totais foram extraídos de ± 1 g de pó usando o método Folch 54. O teor de umidade residual de cada amostra liofilizada foi determinado em duplicata usando um analisador de umidade (MA 150, Sartorius, Göttiggen, Alemanha) para corrigir os lipídios totais.
Os lipídios totais foram transesterificados sob condições ácidas para obter ésteres metílicos de ácidos graxos. Resumidamente, aproximadamente 10 mg de lipídios/100 µl de solução de CHCl3 (100 µl) foram evaporados com nitrogênio em um tubo Pyrex© de 8 ml (SciLabware - DWK Life Sciences, Londres, Reino Unido). O tubo foi colocado em Hex (0,5 ml) (PESTINORM®SUPRATRACE n-Hexano > 95% para análise de traços orgânicos, VWR Chemicals, Radnor, PA, EUA) e solução Hex/MeOH/BF3 (20/25/55) (0,5 ml) em banho-maria a 70°C por 90 minutos. Após resfriamento, foram adicionadas solução aquosa de H2SO4 a 10% (0,2 ml) e solução saturada de NaCl (0,5 ml). Misture o tubo e encha a mistura com Hex limpo (8,0 mL). Uma porção da fase superior foi transferida para um frasco e analisada por cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (GC-FID). As amostras foram analisadas usando um Trace GC Ultra (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) equipado com um injetor split/splitless (240 °C) em modo split (fluxo dividido: 10 mL/min), uma coluna Stabilwax®-DA ( 30 m, 0,25 mm de diâmetro interno, 0,25 μm, Restek Corp., Bellefonte, PA, EUA) e um FID (250 °C). O programa de temperatura foi definido da seguinte forma: 50 °C por 1 min, aumentando para 150 °C a 30 °C/min, aumentando para 240 °C a 4 °C/min e continuando a 240 °C por 5 min. Hex foi utilizado como branco e um padrão de referência contendo 37 ésteres metílicos de ácidos graxos (Supelco 37-component FAMEmix, Sigma-Aldrich, Overijse, Bélgica) foi utilizado para identificação. A identificação de ácidos graxos insaturados (UFAs) foi confirmada por GC bidimensional abrangente (GC×GC-FID) e a presença de isômeros foi determinada com precisão por uma ligeira adaptação do método de Ferrara et al. 55. Os detalhes do instrumento podem ser encontrados na Tabela Suplementar S3 e os resultados na Figura Suplementar S5.
Os dados são apresentados em formato de planilha Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA). A análise estatística foi realizada no R Studio (versão 2023.12.1+402, Boston, EUA) 56 . Os dados de peso larval, tempo de desenvolvimento e produtividade foram estimados utilizando o modelo linear (LM) (comando “lm”, pacote R “stats” 56 ), pois se ajustam a uma distribuição gaussiana. As taxas de sobrevivência utilizando análise de modelo binomial foram estimadas utilizando o modelo linear geral (GLM) (comando “glm”, pacote R “lme4” 57 ). A normalidade e a homocedasticidade foram confirmadas por meio do teste de Shapiro (comando “shapiro.test”, pacote R “stats” 56 ) e análise de variância dos dados (comando betadisper, pacote R “vegan” 58 ). Após análise pareada de valores de p significativos (p < 0,05) do teste LM ou GLM, diferenças significativas entre os grupos foram detectadas usando o teste EMM (comando “emmeans”, pacote R “emmeans” 59).
Os espectros FA completos foram comparados usando análise de variância de permutação multivariada (ou seja, permMANOVA; comando “adonis2”, pacote R “vegan” 58) usando a matriz de distância euclidiana e 999 permutações. Isso ajuda a identificar os ácidos graxos que são influenciados pela natureza dos carboidratos da dieta. Diferenças significativas nos perfis de FA foram analisadas posteriormente usando comparações pareadas. Os dados foram então visualizados usando análise de componentes principais (PCA) (comando “PCA”, pacote R “FactoMineR” 60). O FA responsável por essas diferenças foi identificado pela interpretação dos círculos de correlação. Esses candidatos foram confirmados usando uma análise de variância unidirecional (ANOVA) (comando “aov”, pacote R “stats” 56 ) seguida pelo teste post hoc de Tukey (comando TukeyHSD, pacote R “stats” 56 ). Antes da análise, a normalidade foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk, a homocedasticidade foi verificada pelo teste de Bartlett (comando “bartlett.test”, pacote R “stats” 56) e um método não paramétrico foi utilizado se nenhum dos dois pressupostos fosse atendido. . As análises foram comparadas (comando “kruskal.test”, pacote R “stats” 56 ), e em seguida foram aplicados os testes post hoc de Dunn (comando dunn.test, pacote R “dunn.test” 56 ).
A versão final do manuscrito foi verificada utilizando o Grammarly Editor como revisor de inglês (Grammarly Inc., São Francisco, Califórnia, EUA) 61 .
Os conjuntos de dados gerados e analisados durante o presente estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação razoável.
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Horário da postagem: 25 de dezembro de 2024